Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Summary

In diesem Protokoll zeigen wir den Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung von rekombinant exprimierten Membranprotein, MexB, wie ein lösliches Protein Waschmittel komplex. MexB ist ein Multidrug-Resistenz-Membran-Transporter aus der opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Multidrug Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder Erreger eine Resistenz gegen ein breites Spektrum von strukturell und funktionell unabhängigen Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika, ist eine aktuelle ernstes Problem im öffentlichen Gesundheitswesen. Das Multidrug-Resistenz ist vor allem auf Energie-abhängigen Efflux-Pumpen. Die Pumpen vertreiben Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika in den externen Datenträger, senken ihre intrazelluläre Konzentration unterhalb einer toxischen Schwelle. Wir untersuchen Multidrug-Resistenz in Pseudomonas aeruginosa, eine opportunistische bakterielle Erreger, die Infektionen verursachen bei Patienten mit vielen Arten von Verletzungen oder Krankheit, z. B. Verbrennungen oder zystische Fibrose, und auch bei immungeschwächten Krebs, Dialyse und Transplantation Patienten. Die wichtigsten MDR Effluxpumpen in P. aeruginosa sind dreigliedrige Komplexe aus einer inneren Membran Proton-Medikament Antiporters (RND), eine äußere Membran-Kanal (OMF) und eine periplasmatische Linker Protein (MFP) ^1-8 zusammen. Die RND-und OMF-Proteine ​​sind Transmembranproteine. Transmembranproteine ​​machen mehr als 30% aller Proteine ​​und sind 65% der aktuellen Wirkstoff-Targets. Die hydrophoben Transmembrandomänen machen die Proteine ​​unlöslich in wässrigen Puffern. Bevor ein Transmembranprotein gereinigt werden kann, ist es notwendig, Puffer-Bedingungen mit einem milden Reinigungsmittel, dass das Protein als ein Protein Waschmittel-Komplex (PDC) ^9-11 gelöst werden können zu finden. In diesem Beispiel verwenden wir eine RND Protein, das P. aeruginosa MexB Transmembran-Transporter, um zu zeigen, wie man eine rekombinante Form eines Transmembran-Protein exprimieren, lösen sie mit Hilfe von Detergenzien und dann reinigen das Protein Waschmittel-Komplexen. Diese Methode kann die Expression, Reinigung und Solubilisierung von vielen anderen rekombinant exprimierten Membranproteinen angewandt werden. Das Protein Waschmittel-Komplexe können später für biochemische oder biophysikalische Charakterisierung einschließlich X-ray Kristallstrukturbestimmung oder Vernetzung Studien verwendet werden.

Protocol

1. Tag 1:

MexB von Pseudomonas aeruginosa wird durch pFB101 kodiert. Die MexB Gen wurde aus P. verstärkt aeruginosa genomische DNA und in die NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen des pET30b + Vektor. Das Konstrukt enthält einen C-terminalen Hexa-Histidin-tag.

1. Das Plasmid wird verwendet, um E. verwandeln coli-Stamm C43 (DE3) ^12, und die Transformanten auf LB Agar mit 30 ug / mL Kanamycin.

2. Tag 2: Nacht-Kulturen:

2. Am Abend sind 4 x 3 ml LB-Kulturen mit 30 ug / mL Kanamycin aus der frischen Transformante Kolonien be....

Discussion

Neben Multidrug-Resistenz, viele lebenswichtige zelluläre Aktivitäten, einschließlich Ionentransport, Zell-Zell-Kommunikation, Vesikeltransport, Wartung der zellulären Struktur und Wirt-Pathogen-Interaktionen beinhalten Proteine, die in die Zellmembran eingebettet sind. Transmembranproteine ​​machen über 30% der bekannten Proteine ​​und sind die Ziele für die Mehrheit der Medikamente heute im Einsatz. Die unsachgemäße Faltung oder Aktivität des Transmembranproteine ​​führen wichtige genetische Krankheiten, darunter Muko.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDS-Probenpuffer	Bio-Rad	161-0737
C43(DE3) E. coli Stamm	Lucigen	60345-1
Kanamycinsulfat	Sigma-Aldrich	K4378
2XYT Medien	Fisher Scientific	BP2466-2
LB Medien	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
Lysozym	Sigma-Aldrich	L7651
Vollständige EDTA-freie Proteasehemmer-Tabletten	Roche Gruppe	11 873 580 001
NaP monobasisch	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dibasisch	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glycerin	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecyl-β-D-Maltopyranosid	Anatrace	D310
15ml	Tuben Corning	430052
Wippe	Fisher Scientific	SSL 4
Talon Metall-Affinitätsharz	Clontech Laboratories	635503
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
10% Polyacrylamid SDS PAGE Gele	Bio-Rad	161-1454
Tris/Glycin/SDS PAGE Laufpuffer	Bio-Rad	161-0732
Kaleidaskop vorgefärbte Molekulargewichtsmarker	Bio-Rad	161-0324
Superose 12 30/10 Säule	GE Healthcare	12 10/300 GL
Amicon Zentrifugalkonzentrator	EMD Millipore	UFC801024
Spritzenfilter	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Fernbach-Kolben	Fisher Scientific	09-552-39
Schüttler zur Aufnahme von Fernbach-Kolben	Fisher Scientific
Akta System	GE Healthcare
J6 Großzentrifuge mit JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter Inc.
1 l Zentrifugenflaschen	Beckman Coulter Inc.
RC-5 Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific, Inc.
SS34 Festwinkelrotor und Rohre	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Sorvall Bodenmodell Ultrazentrifuge	Thermo Fisher Scientific, Inc.
T647.5 Rotor und Rohre mit Kappen	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Französische Druckzelle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032