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1. Tag 1:
MexB von Pseudomonas aeruginosa wird durch pFB101 kodiert. Die MexB Gen wurde aus P. verstärkt aeruginosa genomische DNA und in die NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen des pET30b + Vektor. Das Konstrukt enthält einen C-terminalen Hexa-Histidin-tag.
- Das Plasmid wird verwendet, um E. verwandeln coli-Stamm C43 (DE3) 12, und die Transformanten auf LB Agar mit 30 ug / mL Kanamycin.
2. Tag 2: Nacht-Kulturen:
- Am Abend sind 4 x 3 ml LB-Kulturen mit 30 ug / mL Kanamycin aus der frischen Transformante Kolonien beimpft. Alternativ können die Kulturen aus einem gefrorenen perm geimpft werden.
Diese kleinen Kulturen sind auf einer Walze bei 37 ° C über Nacht gewachsen.
3. Tag 3: Growing 6 Liter Cultures:
- Am Morgen, verwenden Sie den Nacht-Kulturen auf 150 mL LB mit 30 ug / mL Kanamycin impfen. Die Kultur bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- Am Nachmittag, verwenden Sie die kleine Kultur zu 6 x 1L 2xYT Medien mit 30 ug / ml Kanamycin in Fernbach-Kolben zu impfen. (Verwenden Sie 25 ml pro Kultur für eine 1:40-Verdünnung). Wachsen die Kulturen bei 37 ° C bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,4-0,6, ca. 1,5 Stunden
- Wenn die Kulturen der richtigen Dichte zu erreichen, induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mL 1M IPTG. Legen Sie alle Flaschen zurück in den Shaker geben und sie weiterhin bei 30 ° C über Nacht wachsen.
4. Tag 4: Die Ernte von Zellen und Reinigen des Proteins:
- Add-Protease-Inhibitoren, DNAse und Lysozym auf die Pufferlösungen wie folgt: Zu 50 mL der Zelle Resuspensionspuffer, 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml Endkonzentration), 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette und eine Prise von Lysozym . Um 60 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Um weitere 50 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Halten Sie alle drei Lösungen auf Eis.
- Centrifuge die Kulturen 30 min 5.000 Umdrehungen in großen Zentrifuge, um die Zellen zu ernten.
- Resuspendieren der Zellen in 100 mL Zelle Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor Tabletten, 0,1 mg / ml DNase I, Prise Lysozym)
- Pass der Zelle Lösung zweimal durch eine Französisch Druckzelle bei 12.000 psi (762 Überdruck). Sammeln Sie die Zelllysat in eine Flasche auf Eis gehalten kalt.
- Übertragen Sie die Zelllysat auf SS34 Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge, um Zelltrümmer für 30 min entfernt bei 10.000 rpm bei 4 ° C in einem SS-34 Rotor.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand in Ti647.5 Ultrazentrifuge Röhren. Zentrifuge 50 min bei 40.000 rpm bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
- Das Pellet, das die Zellmembranen enthält, in ca.. 25 mL der Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette).
- Übertragen Sie die Membran-Suspension, um eine saubere Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 40.000 rpm in einem Ti647.5 Rotor für 50 min bei 4 ° C.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet gewaschen Membran in 25 mL Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette).
5. TM Protein Solublization:
- Um die resuspendierten Membranen (ca. 25 ml), 6 mL 10% DDM (final Detergenskonzentration = 2% DDM) Rock die Mischung bei 4 ° C für 2 Stunden.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 40.000 rpm für 40 min bei 4 ° C in der Ti647.5 Rotor das lösliche Protein Waschmittel-Komplexe von den unlöslichen Proteinen zu trennen. Speichern Sie die Überstand, der die MexB Protein-Komplexen Reinigungsmittel enthält.
6. IMAC:
- Mix der Überstand aus dem High-Speed-Spin mit dem Talon Metall Affinität Perlen äquilibriert in Resuspensionspuffer erhalten. Inkubieren für 1 Stunde auf einer Walze bei 4 ° C.
- Gießen Sie die Gülle in einen Fließbecher Spalte Körper und entsorgen Sie die Durchströmung.
- Die Säule wird mit 20 mL (10 Säulenvolumen) von IMAC Binding und Waschpuffer (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% DDM)
- Eluieren des Proteins mit IMAC-Elutionspuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 250 mM Imidazol, 0,2% DDM).
- Nehmen Sie sich 15 ul Proben der Elutionsfraktionen, Mix mit je 15 ul 2X SDS-Probenpuffer für die Analyse durch Gelelektrophorese. Spin 30sec in einer Mikrozentrifuge. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamid-SDS-Gel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion zu schätzen.
- Pool der Fraktionen, die die MexB Protein-Komplexen Waschmittel und konzentrieren sie in einem Spin-Konzentrator bei 4 ° C. Achten Sie darauf, dass das Protein nicht ausfällt bei dieser step.
7. Gelfiltrationssäule:
- Pre-Gleichgewicht einer Superose 12 HL 30/10 Säule mit 24 ml Laufpuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% beta-Octylglucosid), und warten Sie auf eine flache Basislinie.
- Spülen Sie den Akta Systembelastung Schleife mit Laufpuffer.
- Filtern Sie die Protein-Lösung mit einer Spritze Filter vor dem Auftragen auf die Säule.
- Legen Sie bis zu 240 &mgr; l der Proteinlösung auf die Säule, mit einer Proteinkonzentration von bis zu 5 mg / mL.
- Run 1,5 Säulenvolumen (36 ml) Puffer, sammeln 0,25 ml-Fraktionen. 15 ml Elutionsvolumen - Die MexB Protein-Komplexen Waschmittel sollte als ein Peak bei ca. 10 eluieren.
- Take 5 ul Proben der Peak-Fraktionen. Mix jede Probe 1:1 mit 2X SDS-Probenpuffer. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamidgel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion Schätzung
- Pool der Fraktionen, die reines MexB.
8. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1 enthält eine Polyacrylamidgel mit gepoolten Spalte Fraktionen aus der IMAC-Säule und einzelnen Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule. Nach der Gelfiltrationssäule das Protein scheint pure durch Coomassie gefärbten Polyacrylamidgel. Abbildung 2 enthält eine Spur von der Gelfiltrationssäule, die die wichtigsten Gipfel des Proteins Reinigungsmittel komplexen eluting aus der Säule. Der durchschnittliche Ertrag von MexB Protein ist etwa 2 mg pro 6 Liter 2xYT Kultur.
Abbildung 1. SDS-PAGE-Gel der Reinigung von MexB PDCs. Lane 1, Molekulargewichtsmarker. 2, IMAC Fraktionen gepoolt. 3-7, Gelfiltrationssäule Fraktionen.
Abbildung 2. Beispiel Gelfiltration Ergebnisse für MexB Protein Waschmittel-Komplexe (PDC).