Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen Ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Whole Embryo Culture (WEC) Technik hat im Jahr 1950 ist schon von New und seine Kollegen entwickelt und angewendet für Entwicklungsbiologie 1. Obwohl die Entwicklung und das Wachstum von Säugetieren Embryonen hängt entscheidend von der Funktion der Plazenta sind, ermöglicht WEC Technik uns zur Kultur Maus und Ratte Embryonen ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stadien während der embryonalen Tag (E) 6,5-E12.5 in der Maus oder E8.5-E14.5 in der Ratte 2, 3, 4. In WEC, können wir direkt Bereichen von Embryonen mit feinen Glaskapillaren gewünschte Ziel, weil Embryonen unter dem Mikroskop manipuliert werden kann. Daher ist Nagetier WEC sehr nützliche Technik, wenn wir auf dynamische Entwicklungsprozesse postimplanted Säugerembryonen studieren wollen. Up to date, haben verschiedene Typen von WEC-Systeme bereits 1 entwickelt. Unter denen ist die Rotor-Typ Flasche Kultursystem beliebtesten und eignet sich für langfristige Kultur der Embryonen midgestation, dh nach E9.5 und E11.5 in der Maus und Ratte, bzw. 1. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte WEC nach E12.5 mit einem verfeinerten Modell der ursprünglichen Rotator System, das von Neu-und Cockroft 5, 6 entwickelt wurde, und stellen verschiedene Anwendungen der WEC-Technik für ein Studium in Säugetier-Entwicklung Biologie.
Protokoll
1. Einrichten des WEC-System
- Joint ein 0,22 um Membranfilter mit dem Einlass Silikonschlauch im WEC-System a).
- Öffnen Sie das Ventil einer Gasflasche mit O 2 (95%) und CO 2 (5%). Durchfluss des Gasgemisches in die Trommel über die sprudelnde Flasche mit Wasser autoklaviert.
- Passen Sie den Volumenstrom des Gasgemisches zu 50 cc.
- Legen Sie die aus lassen Silikonschlauch in eine Flasche Wasser und überprüfen Sie die Strömung von Gas-Gemisch.
- Drehen Sie die Trommel mit einer Geschwindigkeit von 20 U / min.
2. Vorbereitung des Kulturmediums
- Tha....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Es gibt zwei kritische Schritte in Nagetier WEC für den Erfolg. Erstens sollte die Dissektion Verfahren genau nicht zu beschädigen Embryonen, vor allem die Blutgefäße. Zweitens sollte das Verfahren so schnell wie möglich sein, da Sauerstoff und Nährstoffen nicht mehr versorgt werden über die Plazenta nach der Isolierung aus der Gebärmutter. Dies ist entscheidend für ältere Embryonen. Im Fall der Ratte WEC nach E12.5, sollten wir seziert Embryonen in Kultur-Flaschen Transfer innerhalb von 30 Minuten.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Herrn Hajime Ichijo für Video-Aufzeichnung und hilfreiche Ratschläge für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch Drs.Yuji Tsunekawa und Kaichi Yoshizaki für Art-Assistent für Video-Aufzeichnung. Diese Arbeit wird durch KAKENHI am Young Scientist B und auf die vorrangigen Bereiche-Molecular Brain Science aus MEXT von Japan unterstützt. Wir erkennen die Unterstützung der Global COE Program "Basic und Translational Research Center for Global Brain Science" von MEXT Japans und der Core Research für Entwicklungskreis Science and Technology (CREST) aus der japanischen Science and Technology Corporation aus Japan Science and Technology Agency (JST) .
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Name | Typ | Firma | Catalog Number | Kommentar |
| Einrichten WEC | ||||
| WEC-System (10-0310) | Werkzeug | Ikemoto Rika | 010-0310 | Ein weiteres kleines Modell ist ebenfalls erhältlich. |
| Silicon-Stecker, ohne ein Loch | Werkzeug | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas-Gemisch Zylinder | Werkzeug | Nikko Sanso | - | Mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid. Benutzerdefinierte Reihenfolge. |
| Gasregler | Werkzeug | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0,22 um Filter Millex GS | Werkzeug | Millipore | SLGS033SS | |
| Anästhesie und Isolierung der Gebärmutter | ||||
| Große Schere | Werkzeug | Napox | B-7H | |
| Zange | Werkzeug | Napox | A-3-2 | |
| Entsorgung Petrischale (90 mm x 15 mm) | Werkzeug | Iwaki | SH90-15 | Deep-Typ Gericht ist der beste für die Präparation. |
| Isofluran | Reagens | Abbott | B506 | Für Anästhesie |
| Pentobarbital-Natrium | Reagens | Schering-Plough Animal Health | - | Für Anästhesie |
| Tyrode-Salzlösung | Reagens | - | - | Nach wie das Protokoll in Ref. 2. Sparen Sie bei 4 ° C. |
| Timed-trächtigen Sprague-Dawley Ratten | Tier | Charles Rivers Laboratories in Japan | - | |
| Vorbereitung des Kulturmediums | ||||
| Kultur Glasflasche | Werkzeug | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Entsorgung Kultur Flasche | Werkzeug | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon-Stecker mit Loch | Werkzeug | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminiumfolie | Werkzeug | Jedes Unternehmen, | - | |
| Autoklavieren Tasche | Werkzeug | Högy | HM-26 | Für Kultur-Flaschen |
| Autoklavieren Tasche | Werkzeug | Högy | HM-14A | Für Silikonstopfen |
| 0,45 um Filter Millex HA | Werkzeug | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml konischen Rohr | Werkzeug | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml Becher | Werkzeug | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC Serum | Reagens | Charles Rivers Laboratories in Japan | - | Siehe: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336, Fax: +81- (0) 45-474-9340 |
| D (+)-Glucose | Reagens | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotika-antimyotic Flüssigkeit | Reagens | Gibco | 15240 | |
| Dissection von Embryonen | ||||
| Ophthalmic gerade Schere | Werkzeug | Napox | MB50-7 | Zum Schneiden der Gebärmutterwand |
| Ophthalmic gebogene Schere | Werkzeug | Napox | MB54-2 | Zum Schneiden der Dottersack |
| Zange # 5 | Werkzeug | Kraft | T6715 | |
| Zange # 5F | Werkzeug | Regine | T6819 | |
| Glaspipette | Werkzeug | - | - | Made by Hand mit Pasteurpipette. |
| Autoklavieren Tasche | Werkzeug | Högy | HM-4 | Für Glas-Pipetten |
| Binokulares Mikroskop | Werkzeug | Leica | Mz7s | |
| Licht | Werkzeug | Leica | CLS 150XD | |
| Oil Stein | Werkzeug | Uchida Yoko | 833-2000 | Zum Schärfen der Zange |
| Maschinenöl | Werkzeug | Uchida Yoko | 835-0000 | Zum Schärfen der Zange |
Referenzen
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplanta....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
