Summary
حالما يتم التعرف على الجينات المقاومة للحرارة كما يحتمل أن تكون لمكافحة الملاريا ، لا بد من تقييمها لدورها في الوقاية من العدوى المتصورة داخل البعوض. هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن أن يعاير مدى الإصابات المتصورة من البعوض. وأظهرت أساليب إعداد ثقافة العرسية ، والدم غشاء البعوض تغذية الإنسان ، ويعاير التتر الفيروسية في المعي المتوسط البعوض.
Abstract
حالما يتم التعرف على الجينات المقاومة للحرارة كما يحتمل أن تكون لمكافحة الملاريا ، لا بد من تقييمها لدورها في الوقاية من العدوى المتصورة داخل البعوض. هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن أن يعاير مدى الإصابات المتصورة من البعوض. وأظهرت أساليب إعداد ثقافة العرسية ، والدم غشاء البعوض تغذية الإنسان ، ويعاير التتر الفيروسية في المعي المتوسط البعوض.
Protocol
ألف التحضير للثقافة العرسية :
- جلب دم الإنسان الطازجة والمصل إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء.
- في غطاء الدخان ، تحت ظروف معقمة ، الماصة 1 مل من الدم الحار في أنبوب إيبندورف. وتدور في الدم في جهاز للطرد المركزي لمدة 5 دقائق في الدقيقة 2200. وينبغي أن تكون كرات الدم الحمراء مكعبات ، وإزالة والتخلص من المصل واضحة. غسل erythocytes مع حجم مساو من جديد 3 مرات للحصول على مصل الدم الكامل للgametocytes.
- استرداد ثقافة العرسية من الحاضنة CO 2 أو جرة الشمعة. ينبغي الحفاظ على هذه الثقافة على وسائل الإعلام وتغذية RPMI البعوض في يوم 16 من الثقافة. لتحديد ٪ جود العرسيات في الدم (في يوم 16 من الثقافة) إجراء مسحة رقيقة على شريحة زجاجية مع الدم قطرة واحدة وتنفيذ Geimsa وصمة عار. تحديد عدد الأمشاج في حقل الثقافة الطفيلي. عادة ما يكون في نطاق من 2 -- 4 ٪. حساب حجم الدم الكامل التي سوف تحتاج لتحقيق المطلوب جود العرسيات في الدم ٪ النهائي (0.3 -1 ٪).
- إزالة معظم وسائل الإعلام من ثقافتك العرسية باستخدام الماصة ، مع الحرص على عدم إزعاج أو تمتص الطفيليات (الطفيليات سوف تظهر سوداء مثل وسائل الإعلام في حين سيتم ضوء الوردي / الاحمر). الماصة بقية وسائل الإعلام والطفيليات في أنبوب 15 مل الصقر. تدور في جهاز للطرد المركزي لمدة 5 دقائق في الدقيقة 2200. والطفيليات وبيليه الكريات الحمراء ، وإزالة ، وتجاهل وسائل الاعلام من دون طاف الطفيليات المزعجة.
- الجمع بين الطفيليات مع حجم الدم كله استعداد (من A2 الخطوة) لتعطيك جود العرسيات في الدم المطلوب النهائي وفقا لحسابات سابقة. الماصة لمزيج دقيق. (~ 1 دقيقة)
هذه هي الحال الآن العينة سوف إطعام البعوض الخاص. تبقي على 37 درجة مئوية في حمام الماء.
البعوض باء التغذية :
- وضع الخاص الأنوفيلة البعوض (~ 30-50) في كوب من الورق المقوى الشمع مبطنة مغطاة المعاوضة شبكة المضمون من قبل مجموعة من المطاط أو غطاء من الورق المقوى مزودة الكأس. نستخدم الشافطة يعمل بواسطة بطارية لهذه الخطوة.
- تحضير توزيع المياه حمام بإضافة فتحات على جانبي الزجاج مغذيات لأنابيب مطاطية. كما ربط العديد من مغذيات ما تحتاج إليه في سلسلة ، وينبغي أن تكون متصلا واحدة من نهاية هذه السلسلة من خلال أنابيب إلى شكل دائري للحمام الماء (الجزء الذي يدفع المياه من خلال مغذيات) ، يتعين على الطرف الآخر من سلسلة تتكون من أنابيب مطاطية غارقة في حمام للسماح للمياه فارغة عممت على العودة الى الحمام. بدوره على حمام حتى المياه حوالي 37 درجة مئوية والمياه من خلال تعميم ومغذيات والعودة إلى الحمام. هذا أمر ضروري للحفاظ على الدم الحار والحفاظ على الطفيليات على قيد الحياة.
- إعداد الغشاء (نستخدم مربعات صغيرة من parafilm امتدت) من خلال الزجاج تمتد حول التغذية الغشاء ، وذلك باستخدام الضغط لاغلاق محكم لافتتاح وحدة التغذية. وهذا تقليد غشاء الجلد.
- مكان واحد المغذية الأغشية الجانب السلبي على كل كوب من البعوض ومغذيات آمن باستخدام المشابك أو الشريط. وينبغي أن الغشاء الجلوس مع صافي تدفق البعوض حتى يمكن الوصول إليه من داخل الكأس.
- ماصة بعناية الطفيلي في الدم وجبة (من الخطوة A5) في الرقبة وحدة التغذية ، والتأكد من دم غني عن كل الطريق من خلال العنق في المكمن ، والاتصال الغشاء حتى البعوض يمكن الوصول إلى الدم. نحن نستخدم حوالي 200 ميكرولتر من الدم في التغذية ، ولكن هذا يمكن أن تختلف.
- السماح لتغذية البعوض. سمحنا لهم لتغذية لمدة 30 دقيقة ≈ (متغير ، اعتمادا على theexperiment ؛ بالنسبة لمعظم التجارب ، ورصد بعض الأحيان كيف اتخذت العديد من وجبة من خلال النظر في محتوى الدم في البطن.)
- بعد الرضاعة ، وإزالة مغذيات من كؤوس البعوض. إيقاف حمام المياه ومغذيات من قطع الأنابيب.
- إزالة الغشاء المغذي ونقع في المبيض بنسبة 10 ٪ لتطهير وشطف مع الماء. مكان المواد الملوثة (الأغشية ، والمناشف الورقية ، والقفازات ، الخ) في حقيبة صغيرة وبيولوجية ودائع في وعاء كبير واقية.
- تخدير البعوض عن طريق وضع الأكواب في الثلاجة أو في غرفة باردة. مرة واحدة البعوض تخدير كامل ، ونقل لهم على طبق بتري مضمن في دلو الجليد. البعوض الفرز ، وتبحث بعناية في بطون عن أي علامة على وجبة الدم ، ورفض تلك التي لا الأعلاف. ستكون هناك بعض البعوض محتقن بالكامل في حين أن آخرين سوف تظهر على شريط ضيق من بلعها الدم ؛ كلها مقبولة على أنها "تغذية". وضع البعوض اعادة ادخالها في أكواب من الورق المقوى.
- تقديم وجبة السكر (قطعة من القطن المنقوعة في السكروز 10 ٪) للبعوض ، واحتضان في ظل ظروف طبيعية insectary لمدة 7 أيام. اليومية ، ينبغي رصد البعوض لمعدل الوفيات. أيضا ، ينبغي للقطن مبللة مع السكروز ، بحيث لا يتم حرمانهم من الطعام. فمن الأفضل ، حتى الآن ، إضافة إلى منشفة ورقية المنقوعة في الماء المقطر ، للحفاظ على البعوض رطبة. هذه هي البعوض P. falcipraum المصابة ، لذلك يجب اتخاذ كل الرعاية بحيث لا يستطيع البعوض الهادئه من الكأس. فمن الأفضل لوضع أكواب في حماية cagefor صغيرة مزدوجة.
جيم تشريح midguts البعوض وتقدير الأحمال البيضة المتكيسة :
- نضح البعوض (من الخطوة B) من أكواب من الورق المقوى باستخدام الشافطة التي تعمل بالبطاريات. تخدير البعوض ، والتي هي داخل الخزان الشافطة القابلة للإزالة ، ونقل إلى غرفة باردة أو دفن في خزان الثلج لمدة لا تقل عن 5 دقائق أو حتى البعوض يتوقف عن الحركة.
- نقل البعوض تخدير من الخزان إلى طبق بتري مضمن في الزجاج الجليد. انتشار البعوض إلى طبقة واحدة ، وتغطي بغطاء بلاستيكي طبق بتري. البعوض التي لا يمكن استيعابها على طبق تبقى في الخزان ، الذي عاد إلى الغرفة الباردة أو الثلج.
- باستخدام الملقط غرامة ذات الرؤوس ، ونقل بعوضة واحدة من الطبق إلى 100 الواردة في برنامج تلفزيوني المجاهدين على شريحة زجاجية شنت تحت المجهر تشريح. ترك الآخرين المشمولة في طبق بتري مبردة.
- باستخدام الملقط غرامة ذات الرؤوس ، وعقد البعوض في الصدر والبطن الخلفي. سحب الجسم بعيدا حتى يتم كشفها المعي المتوسط. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة الزائدة من الأمعاء gut.The تبدو بيضاء ، تشبه كيس الجسم. إزالة الأنسجة الزائدة من الأمعاء gut.Mount في بئر واحدة من شريحة زجاجية ال 12 جيدا وتزج في ميكرولتر 50-10 0.2 ٪ mercurochrome. الاسكواش الذبيحة وتجاهل towel.Continue على ورقة رطبة لتكاثر البعوض الأخرى حتى الشريحة 12 - جيدا ممتلئ. تغطية الشجاعة التي شنت مع ساترة الزجاج.
- دراسة الشجاعة تحت المجهر ضوء ، وتبحث عن جولة البيضات التي صمة ردي مشرق واضحة ضد النسيج / خافت الأمعاء الوردي. عدد البيضات وتسجيل ومتابعة عينة المقبل. تواصل لجميع البعوض من جميع العلاجات التجريبية.
- عند الانتهاء ، مسح الشريحة النظيفة مع منشفة ورقية. وضع منشفة ورقية مع الشجاعة ، ومنشفة ورقية مع جثث ، في حقيبة صغيرة بيولوجية وتجاهل في سلة المهملات. يتم ارتداء القفازات في جميع أنحاء الداخلي. هو الحرص على عدم السماح لأي هروب البعوض المصابة.
Discussion
يمكن أن يكون هناك بعض الاختلافات في والعدوى عدوى المتصورة تحديد النمط الظاهري ومختبرات مختلفة قد تتبع أساليب مختلفة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W.
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
