Summary
Как только ген определены как потенциально огнеупорные для борьбы с малярией, он должен быть оценен по его роль в предотвращении инфекций Plasmodium в комара. Этот протокол иллюстрирует степень инфекций плазмодия комаров могут быть проанализированы. Методы подготовки гаметоцит культуры, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.
Abstract
Как только ген определены как потенциально огнеупорные для борьбы с малярией, он должен быть оценен по его роль в предотвращении инфекций Plasmodium в комара. Этот протокол иллюстрирует степень инфекций плазмодия комаров могут быть проанализированы. Методы подготовки гаметоцит культуры, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.
Protocol
А. Подготовка гаметоцит культуры:
- Принесите свежей человеческой крови и сыворотки до 37 ° С на водяной бане.
- В вытяжной шкаф, в стерильных условиях, пипетки 1 мл теплой крови в пробирку Эппендорф. Спиновые крови в центрифуге в течение 5 минут при 2200 оборотах в минуту. Эритроциты должны быть гранулированный; удалить и уничтожить ясно сыворотки. Вымойте эритроцитах с равным объемом новой сыворотки 3 раза, чтобы получить цельную кровь для гаметоциты.
- Получить гаметоцит культуры из CO 2 инкубаторе или декоративный стеклянный колпак. Эта культура должна быть сохранена на RPMI СМИ и подается на комаров на 16 день от культуры. Чтобы определить, gametocytemia% (на 16 день от культуры) делают тонкий мазок на предметное стекло с одной капле крови и выполнять Geimsa пятно. Определить количество половых клеток в области культуры возбудителя. Как правило, в диапазоне от 2 - 4%. Рассчитайте объем цельной крови, что вам нужно для достижения желаемого конечного gametocytemia% (0,3 -1%).
- Удалите большинство средств массовой информации с вашего гаметоцит культуры с помощью пипетки, заботясь, чтобы не нарушить или подлизываться паразиты (паразиты будут выглядеть как черный в то время как СМИ будут светло-розовый / красный). Внесите остальные средства массовой информации и паразитов в 15 мл трубки сокола. Спина в центрифуге в течение 5 минут при 2200 оборотах в минуту. Паразиты и эритроцитов будет гранул, удалять и отбрасывать СМИ супернатант, не нарушая паразитов.
- Комбинат паразитов с объемом подготовлена цельная кровь (с шагом А2), чтобы дать вам желаемое окончательное gametocytemia в соответствии с предыдущими расчетами. Внесите, чтобы тщательно перемешать. (~ 1 минуты)
Теперь это пример, который будет кормить, чтобы ваши комаров. Хранить при температуре 37 ° С на водяной бане.
Комары Б. Питание:
- Положите вашу малярийных комаров (~ 30-50) на вощеной картонные стаканы покрыты сеткой сетки обеспеченных резинкой или картонные крышки поставляются с чашкой. Мы используем батарейках аспиратор для этого шага.
- Подготовить обращение водяной бане, вставив сопла с обеих сторон стекла отводов к резиновой трубки. Подключиться как много фидеров, сколько вам нужно в серии, один конец серии должны быть соединены трубкой циркулятор в водяной бане (часть, которая выталкивает воду через питатели), другой конец серия должна состоять из резиновой трубки погружен в ванну, чтобы распространить воду, чтобы очистить обратно в ванну. Включите ванну, пока вода составляет около 37 ° С, и вода циркулирует через питатели и обратно в ванну. Это очень важно сохранить кровь теплой и держать паразитов живым.
- Подготовка мембраны (мы используем небольшие квадраты растягивается парафильмом), растягивая вокруг подачи стеклянной мембраны, используя давление плотно прилегают к фидерных открытия. Эта мембрана будет имитировать кожу.
- Разместите один фидер мембраны стороной вниз на каждой чашке комаров и безопасной подачи помощью зажимов или магнитную ленту. Мембраны должны сидеть на одном уровне с чистым так комары могут получить к нему доступ из внутри чашки.
- Тщательно пипетки паразитами крови еды (с шагом А5) в горловину подачи, убедившись, что кровь проходит весь путь через шею в пласт, связавшись мембраны так комары могут получить доступ крови. Мы используем около 200 мкл крови в устройство подачи, но это может варьироваться.
- Разрешить комаров кормить. Мы позволяем им корма для ≈ 30 минут (переменная, в зависимости от theexperiment, ибо большинство экспериментов, время от времени мониторинг, сколько уже приняли еду, глядя на крови содержание в животе.)
- После кормления, удаления фидеров от комаров чашки. Выключите водяной бане и отсоединить фидеров из труб.
- Удаление мембраны и замочить фидеров в 10% гипохлоритом натрия для обеззараживания и смыть водой. Место загрязненный материал (мембраны, бумажные полотенца, перчатки и т.д.) в небольшую сумку и биологически опасных депозит в большой сосуд биологической опасности.
- Обезболить комаров путем размещения чашек в холодильнике или холодном помещении. Как только комары полностью наркоза, передачи их на чашку Петри встроенных в ведерке со льдом. Сортировать комаров, внимательно всматриваясь в живот при любом знаке крови еды, и отбросить те, которые не кормили. Некоторые комары будут полностью наполненный то время как другие показывают, узком диапазоне поглощенной крови, и все являются приемлемыми как "кормят". Положите кормили комаров обратно в картонные стаканчики.
- Обеспечить сахара мука (кусочек ваты пропитанной 10% сахарозы) для комаров, и инкубировать при нормальных условиях insectary течение 7 дней. Каждый день, комары, следует наблюдать на смертность. Кроме того, хлопка должны быть мокрыми от сахарозы, так что они не лишены пищи. Лучше, однако, добавить бумажным полотенцем пропитанной дистиллированной воды, чтобы сохранить комаров влажной. Эти комары П. falcipraum инфицированных, так что все необходимо соблюдать осторожность, чтобы не комары могут ЭСКАТОе из чашки. Лучше всего поставить чашки в небольшом cagefor двойную защиту.
С. Пройдя комаров midguts и оценки ооцисты нагрузок:
- Аспирируйте комаров (из шага B) из картона чашках, с использованием батарейках аспиратора. Обезболить комаров, которые находятся внутри съемного резервуара аспиратор, при переходе на холодном помещении или захоронение водохранилище во льду в течение 5 минут или пока комары перестали двигаться.
- Передача под наркозом комаров из резервуара в стеклянном блюде Петри встроенные в лед. Распространение комаров в один слой и накрыть пластиковой крышкой чашке Петри. Комары, которые не могут быть размещены на блюде остаются в водоеме, который возвращается в холодное помещение или льда.
- Использование с острым концом щипцов, передача одного комара от блюда к 100 мкл PBS, содержащихся на стекле установлен под рассечение микроскопом. Оставьте другие покрыты охлажденной чашке Петри.
- Использование с острым концом щипцы, держать комаров на грудной клетке и задней части живота. Вытяните тело на части, пока кишки подвергается. Используйте пинцет, чтобы удалить лишнюю ткань gut.The кишки выглядит как белый, мешок типа тела. Удалите излишки ткани gut.Mount кишки в одну лунку 12-а предметное стекло и погрузиться в 5-10 мкл 0,2% Меркурохром. Сквош туши и выбросить на влажные towel.Continue бумаги для других комаров до 12-и слайд полном объеме. Обложка установлен кишки с покровным стеклом.
- Изучить кишки под световым микроскопом, глядя на круглый ооцист, что пятно ярко-розового против ясного / слабый розовый ткани кишечника. Граф ооцист, запись и перейдите к следующему образцу. Продолжить для всех комаров из всех экспериментальных методов лечения.
- Когда закончите, протрите чистой слайд с бумажным полотенцем. Место бумажным полотенцем с кишками, а бумажное полотенце с тушами, в небольшую сумку и биологически опасных отбросить в мусорное ведро. Перчатки носят всей процедуры. Уход берется не допустить, чтобы избежать любых инфицированных комаров.
Discussion
Там могут быть некоторые изменения инфекции Plasmodium и определение инфекции фенотип и различных лабораториях могут последовать различные методы.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W.
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
