Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-virale Methode der Lieferung von Gen-Konstrukte zu einem bestimmten Bereich des Gehirns lebende Nagetier. Die Methode besteht aus Plasmid-Präparation, Mikropipette Fertigung, neugeborenen Ratten pup Chirurgie, Mikroinjektion des Konstrukts und In vivo Elektroporation.
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Methodenartikel
Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Erstellung von transgenen Tieren ist ein Standard-Ansatz bei der Untersuchung von Funktionen eines Gens von Interesse in vivo. Allerdings sind viele Knockout oder transgenen Tieren, die nicht in den Fällen, wo das modifizierte Gen exprimiert oder gelöscht wird in den gesamten Organismus lebensfähig. Darüber hinaus eine Vielzahl von Kompensationsmechanismen machen es oft schwierig, die Ergebnisse zu interpretieren. Die kompensatorische Effekte können entweder durch Timing der Genexpression oder die Begrenzung der Höhe von transfizierten Zellen vermindert werden.
Die Methode der postnatalen nicht ventrikuläre Mikroinjektion und in vivo Elektroporation ermöglicht die gezielte Verabreichung von Genen, siRNA oder Farbstoffmoleküle direkt auf eine kleine Region des Interesses an der neugeborenen Nagern Gehirn. Im Gegensatz zu herkömmlichen ventrikuläre Injektionstechnik ermöglicht diese Methode die Transfektion von nicht-wandernde Zelltypen. Tiere mit Hilfe der hier beschriebenen Methode transfiziert kann, zum Beispiel für Zwei-Photonen werden in-vivo-Bildgebung oder in elektrophysiologischen Experimenten an akuten Hirnschnitten.
Protokoll
1. Einführung
Erstellung von transgenen Tieren ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung von Genfunktionen in lebenden Tieren 1 und zur Enträtselung Krankheitsmechanismus 2,3 sowie für die Manipulation von Eigenschaften der Zellen 4. Allerdings ist das Verfahren ziemlich aufwendig, extrem zeitaufwendig und teuer, so rechtfertigt die Verwendung von alternativen Gentransfer-Methoden wie virale Injektion 5, neonatalen ventrikulären Injektion mit Elektroporation 6 und in utero Elektroporation 7,8. Die Methode der postnatalen nicht ventrikuläre Injektion und Elekt....
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Diskussion
Methoden der Gentransfer in lebende Nagetier Gehirn sind gut für die in utero Elektroporation 7,8,11,12 gegründet und seit kurzem auch für die postnatale Elektroporation 6. Allerdings sind diese Methoden auf intraventrikuläre Injektion der Plasmid-DNA, die für mehrere Anwendungen kann die Begrenzung basiert. Zum Beispiel, haben diese Methoden nicht zulassen, dass Targeting-Zellen in bestimmten Bereichen des Gehirns wie Hippocampus, noch die Transfektion von solchen nicht-wandernde Zelltype.......
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Danksagungen
Wir danken Ekaterina Karelina für die Hilfe bei der Aufnahme Soundtrack für das Video, Ivan Molotkov für 3D-Animation und Dr. Peter Blaesse für CAG-EGFP Plasmid-Präparation.
Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Zentrum für Internationale Mobilität von Finnland, Finnish Cultural Foundation und der Academy of Finland unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa Dumme Pinzette, 115 mm | Gerät | XYtronic | XY-2A-SA | Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Biologischer Temperaturregler mit Heizplatte aus Edelstahl | Gerät | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilikat-Röhrchen mit Filament | Material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glasnadel |
| Einwegbohrer | Material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Reagenz | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 Pinzette, 110 mm | Gerät | Fine Science Tools | 91150-20 | Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Ealing Mikro–Elektrodenzieher | Gerät | Ealing | 50-2013 | Vertikaler Glas-Elektrodenzieher |
| Ethilon Monofil-Polyamid 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | Material | Johnson & Johnson | EH7177H | Chirurgische Fäden |
| Exmire Mikrospritze 10,0 ml | Gerät | Exmire | MS*GLLX00 | Gasdichte Spritze |
| Fast Green | Reagenz | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Pinzetten-Elektroden | Gerät | BEX | LF650P3 | Vor der Verwendung zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Foredom Bohrsteuerung | Gerät | Foredom | FM3545 | Stromversorgung und Steuerung für chirurgischen Bohrer. Aktuell verfügbares Analogmodell ist das Mikromotor-Kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom Mikromotor-Handstück | Gerät | Foredom | MH-145 | Aktuell verfügbares Analogmodell ist das Mikromotor-Kit K.1070 (Foredom) |
| Gasanästhesieplattform für Mäuse | Gerät | Stoelting Co. | 50264 | Auf stereotaktischem Instrument montiert |
| Isofluran | Reagenz | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Mikro-Hautpinzette, 105 mm | Gerät | Aesculap | BD302R | Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Microfil | Material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Kapillaren zur Befüllung von Mikrospritzen |
| Mineralöl | Reagenz | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil-Spritze 10 Mikroliter | Gerät | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton-Spritze |
| Plasmid CAG-EGFP | Reagenz | Mit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) extrahiert und gereinigt, in nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml gelöst | ||
| Puls-Generator CUY21Vivo-SQ | Gerät | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller Elektroden-Gel | Reagenz | Schiller AG | 2.158000 | Leitfähiges Gel |
| Stereotaktisches Instrument für Kleintiere | Gerät | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting Maus- und Neugeboren-Ratten-Adapter | Gerät | Stoelting Co. | 51625 | Auf stereotaktischem Instrument montiert. Ohrstifte vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Schüler-Iris-Scheren, gerade 11,5 cm | Gerät | Fine Science Tools | 91460-11 | Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln |
| Sugi Saugtupfer 17 x 8 mm | Material | Kettenbach | 31602 | Chirurgische Tampons |
| UMP3 Mikrospritzpumpe und Micro 4 Mikrospritzpumpen-Regler | Gerät | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Mikroinjektor und Regler |
| Univentor 400 Anästhesiegerät | Gerät | Univentor | 8323001 |
Referenzen
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2
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Nachdrucke und Genehmigungen
