Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של שלם
Abstract
שיפורים אחרונים הדמיה אופטית, fluorophores מקודדים גנטית וכלים הגנטי המאפשר הקמת יעיל של קווי הרצוי חיים מהונדס אפשרו תהליכים ביולוגיים להיחקר בהקשר של פרנסה, ובמקרים מסוימים אפילו מתנהג, האורגניזם. בפרוטוקול זה נתאר כיצד להרדים שלם הזחלים תסיסנית, באמצעות הרדמה נדיפים desflurane, לעקוב אחרי התפתחות של אוכלוסיות פלסטיות סינפטית על המשנה הסלולר ברזולוציה 1-3. בעוד שיטות שימושיים נוספים להרדים הזחלים תסיסנית melanogaster תוארו בעבר 4,5,6,7,8, פרוטוקול המוצגת כאן ממחישה שיפורים משמעותיים בשל התכונות הבאות מפתח משולב: (1) רמה גבוהה מאוד של הרדמה, אפילו פעימות הלב הוא נעצר המאפשר ברזולוציה ננומטר לרוחב של עד 150 1, (2) שיעור הישרדות גבוה של 90%> בכל מחזור הרדמה, המתירה הקלטה של יותר מחמש נקודות זמן על פני תקופה של שעות עד ימים 2 ו ( 3) רגישות גבוהה המאפשרת לנו 2 מקרים ללמוד את הדינמיקה של חלבונים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות. בפירוט, היינו יכולים לחזות את קולטן הגלוטמט postsynaptic למקטע GluR-IIA לידי ביטוי באמצעות האמרגן אנדוגני 1 בקווים מהונדס יציבה קו מלכודת אקסון FasII-GFP 1. (4) בניגוד לשיטות אחרות 4,7 הזחלים ניתן הדמיה לא רק חי, אלא גם שלמות (כלומר לא גזור) המאפשר תצפית להתרחש על פני מספר ימים 1. הפרטים וידאו המלווה את הפונקציה של חלקים בודדים של in vivo הדמיה תא 2,3, הנכון הרכבה של הזחלים, הליך הרדמה, איך מחדש לזהות עמדות ספציפיות בתוך הזחל לבין הסרת בטוחה של הזחלים מן הדמיה קאמרית.
Protocol
א ') בעצרת של תא הדמיה
- בחר הזחל של השלב שנבחר (למשל מוקדם 3 rd הזחלים עוזבים instar מרווח התבוננות של כ 24 שעות במהירות של 25 ° C עד נדודים הבמה).
- שוטפים את הזחל עם מים לנקות את זה במדיום תרבות מורחת אותו יבש.
- סמל מרכז אלמנט התחתון של החדר, האזור להתמודד עם הזחל, עם שכבה דקה של שמן halocarbon.
- שימו את הזחל עם הצד הגחוני מול המטרה מיקרוסקופ בחדר (מאפשר neuromuscular צומת (NMJ) 26 ו 27 כדי להיות צילמו) (איור 1 AE).
- מניחים את spacer פלסטי על שכבת שמן, עם חריצי אוויר של הפנים כלפי מעלה לרשת (איור 1). ודא בשלב זה: גובה spacer הוא בערך מחצית הקוטר הזחל, רוחב החריץ צריך להיות בערך פעמיים את הקוטר של הזחל.
- הנח את תא הדמיה על המיקרוסקופ
ב) הרדמה של הזחל
- חיבור שני פתחי הכניסה של החדר עם הרדמה מתאימה למכשיר / מאדה.
אנא ודא-up מול:
ריכוז יעיל של desflurane באוויר חדר לא יעלה על זה שצוין על ידי תקנות הבטיחות! רק בהיקף כולל קטן מאוד של desflurane יש צורך להרדים הזחלים. יישום של 15% (V / V) של 1 desflurane הוכיחה להיות נקודת התחלה טובה לקביעת ריכוז אידיאלי לשמש בניסוי. מטעמי בטיחות אנו מציעים מאדה לעולם לא יכילו יותר מ desflurane הדרושים 2-4 שעות בתחום ההדמיה vivo. - לטבול את הקצה השני של הצינור המחובר לשקע קאמרית כוס מים ולאחר מכן פתח את השסתומים שליטה על הזרימה של חומר הרדמה אל תוך החדר במשך כחמש שניות.
ודא בשלב זה:
האם לעלות בועות אוויר בתוך המים? אם לא חדר הוא דולף. - סגור את השסתומים במשך כשלוש שניות.
- צג תנועות הזחל שיורית המיקרוסקופ. בדוק גם את פעימות הלב ואת תנועות שרירים. אם שסתומים לפתוח ולסגור הכרחי כמתואר בשלב 8 ו -9 עד הרדמה של הזחל תושלם, ואז לסגור את כל שסתומי ולהתחיל הדמיה.
ודא בשלב זה:
תנועת שריר הלב או שיורית מציין כי הזחל אינו מורדם כראוי. הרדמה מלאה חיונית תמונות ברזולוציה גבוהה. הזחל בדרך כלל לא צריך להיות מורדם יותר מ 15-20 דקות בכל זמן נתון.
ג) הדמיה
- זהה את העמדה הנכונה התמונה את המבנה של עניין (איור 2-4).
ד) השחזור הרדמה
- לאחר השלמת הדמיה לתת אוויר לתוך החדר.
ודא בשלב זה:
בדוק דופק התכווצויות שרירים של זחל על ידי אור הלוגן המשודר. כאשר השרירים מתחילים קבלנות זה בטוח כדי להסיר את הזחל מן החדר הדמיה. - ניתוק הקאמרית מהמכשיר הרדמה ולהסיר ממנו המיקרוסקופ. לפרק את התא בזהירות המקום הזחל במדיום לטוס מחית טיפוח.
- אחסן את המנה באינקובטור בטמפרטורה המתאימה.
ה) זמן סדרה
- חזור על השלבים עד 2-14 נקודות מספיק זמן הושגו.
פרוטוקול אלטרנטיבי:
אם הזחל הוא להיות צילמו יותר מפעם אחת בתוך מרווח של 30 דקות זה יכול להיות מעשי להשאיר אותו בתא הדמיה עד נקודת הרדמה בפעם הבאה. חזור על השלבים עד 7-14 נקודות מספיק זמן הושגו.
ודא בשלב זה:
הזחל לא להיות כל הזמן בחדר הדמיה במשך יותר משעתיים בכל פעם, וגם לא להיות מורדמים יותר מ 15-20 דקות בכל פעם.
איור 1 העצרת של החדר הדמיה. (א) הנח את הזחל ואת spacer פלסטי על שכבת שמן. (ב) מקום 22 x 22 מ"מ לכסות להחליק על spacer ולהכניס את הטבעת מדריך פרספקס לתוך החדר, ליד (ג) לתקן את המיקום של הזחל עם טבעת מתכת (ד ') לסגור את החדר. (ה) עכשיו החדר הוא מוכן להיות מותקן על המיקרוסקופ.
תרשים 2 קיר גוף שרירי הזחלים תסיסנית. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AC) השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב (KL) שרירי פנים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר.
איור 3 זהות הגוף קיר השרירים הזחלים תסיסנית. זהותו של השרירים הזחלים תסיסנית L3, A3 מגזר, מוצג. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחלים. ב AC השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב KL את השרירים הפנימיים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר.
איור 4 זהות של צמתים neuromuscular של הזחלים תסיסנית. (AD) NMJs היו דמיינו ידי ביטוי של חלבון היתוך DGluRIIA-mRFP 1. NMJs מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AB) NMJ שטחית ביותר, 27, מוצגת, ב CD NMJs הפנימי ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות הוא 5 מיקרומטר. (ה) ו - (F) את זהותו של השטחי (E) פנים יותר (F) NMJs ניתנת התייחסות.
Discussion
השיטה פותחה בתחילה הציג ללמוד סינפסות glutamatergic על הקיר שרירי הגוף של הזחלים melanogaster תסיסנית. Neuromuscular תסיסנית צומת (NMJ) מתאפיינת בארכיטקטורה Cyto-סטריאוטיפית של השרירים נוירונים ועל כן אידיאלי עבור הדמיה vivo. עם זאת, פרוטוקול הרדמה המתואר אינו מוגבל הדמיה NMJ; את השקיפות של הזחלים תסיסנית מאפשר עיבוד של פרוטוקול המתואר ללמוד על התפתחות איברים, הגירה של תאים, הובלת מטען axonal ותת הסלולר מחדש בתוך התאים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים אנדריאס Schönle, מקס פלאנק, המכון לכימיה Biophysical, גרמניה דוד י סאנדסטרום, המכון הלאומי לבריאות הנפש, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ארה"ב ייעוץ טכני. אנו מודים פרנק Kötting, אירופה Neuroscience Institute, גטינגן לבניית תא הדמיה המכשיר הרדמה. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של Forschung אלצהיימר היוזמה TMRYZ נתמך על ידי מענק של מלגות סין המועצה, SBH על ידי מענק של המדרשה עבור תאית ומולקולרית Neuroscience, מאוניברסיטת טובינגן.
Materials
Reagents:
Equipment:
|
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , Georg-August-University Göttingen. (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
