Summary
Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van intacte
Abstract
Recente verbeteringen in optische beeldvorming, genetisch gecodeerd fluoroforen en genetische instrumenten die een efficiënte inrichting van de gewenste transgene dier lijnen in staat hebben gesteld biologische processen te bestuderen in de context van een leven, en in sommige gevallen zelfs gedragen, organisme. In dit protocol zullen we beschrijven hoe intact Drosophila larven, met behulp van de vluchtige anesthetica desfluraan, aan de ontwikkeling en plasticiteit van synaptische populaties op sub-cellulair resolutie 1-3 te volgen verdoven. Terwijl andere nuttige methoden om de Drosophila melanogaster larven verdoven zijn eerder beschreven 4,5,6,7,8, het protocol hierin gepresenteerd toont significante verbeteringen te wijten aan de volgende combinatie belangrijkste eigenschappen: (1) Een zeer hoge mate van verdoving, zelfs de hartslag wordt gearresteerd waardoor laterale resolutie tot 150 nm 1, (2) een hoge overlevingskans van> 90% per cyclus verdoving, waardoor de opname van meer dan vijf tijdstippen gedurende een periode van uren tot dagen 2 en ( 3) een hoge gevoeligheid waardoor we in twee gevallen aan de dynamiek van eiwitten die worden uitgedrukt in fysiologische hoeveelheden te bestuderen. In detail, we waren in staat om de postsynaptische glutamaat receptor subeenheid GluR-IIA uitgedrukt via de endogene promotor 1 in stabiele transgene lijnen en de exon val lijn FasII-GFP een te visualiseren. (4) In tegenstelling tot andere methoden 4,7 de larven kunnen worden afgebeeld, niet alleen in leven, maar ook intact zijn (dwz niet-ontleed), zodat observatie te komen over een aantal dagen een. De bijhorende video details van de functie van de afzonderlijke onderdelen van de in vivo beeldvorming kamer 2,3, de correcte montage van de larven, de verdoving procedure, hoe opnieuw vaststellen van specifieke posities binnen een larve en de veilige verwijdering van de larven van de beeldvorming kamer.
Protocol
A) Montage van de imaging-kamer
- Selecteer een larve van de gekozen fase (bijv. vroege 3e instar larven verlaten van een observatie-interval van ongeveer 24 uur bij 25 ° C tot zwervende stadium).
- Spoel de larve met water te reinigen van het kweekmedium en dep het droog.
- Smeer het midden van het onderste element van de kamer, de regio om de larve gezicht, met een dunne film van de halogene olie.
- Zet de larve met de ventrale zijde naar de microscoop doel in de kamer (maakt neuromusculaire junctie (NMJ) 26 en 27 af te beelden) (Figuur 1 AE).
- Plaats de plastic spacer op de olie-laag, met de lucht sleuven van het raster gezicht naar boven (Figuur 1 A). Controleert bij deze stap: De hoogte van de spacer is ongeveer de helft van de larven diameter, moet de breedte van de gleuf worden ongeveer twee keer de diameter van de larve.
- Plaats de beeldvorming kamer op de microscoop
B) verdoving van de larve
- Sluit de twee inhammen van de kamer met een geschikte verdoving apparaat / verdamper.
Controleer up-front:
De effectieve concentratie van desfluraan in de ruimte-lucht mag nooit hoger zijn dan door de veiligheidsvoorschriften in acht! Slechts een zeer klein totaal volume van desfluraan is nodig om larven verdoven. De toepassing van 15% (v / v) van desfluraan 1 heeft zich bewezen als een goed uitgangspunt voor het bepalen van de ideale concentratie om gebruikt te worden in een experiment. Om veiligheidsredenen raden wij de vaporizer nooit moet bevatten meer desfluraan dan nodig voor 2-4 uur van in vivo beeldvorming. - Dompel het andere uiteinde van de buis aan de kamer stopcontact in een glas water en open de kleppen regelen van de doorstroming van de narcose in de kamer voor ongeveer vijf seconden.
Controleert bij deze stap:
Doe luchtbellen opstijgen in het water? Als dat niet de kamer is lekkende. - Sluit de kleppen voor ongeveer drie seconden.
- Monitor resterende larvale bewegingen in de microscoop. Controleer zowel de hartslag en spierbewegingen. Indien nodig openen en sluiten van kleppen, zoals beschreven in stap 8 en 9 tot verdoving van de larve is voltooid, sluit vervolgens alle kleppen en start beeldvorming.
Controleert bij deze stap:
Resterende spierbeweging of hartslag geeft aan dat de larve niet goed verdoofd. Volledige verdoving is van vitaal belang voor hoge resolutie beelden. De larve moet normaal niet verdoofd worden voor langer dan 15-20 minuten op een gegeven moment.
C) Imaging
- Bepaal de juiste positie en het imago van de structuur van belang (figuur 2-4).
D) Herstel van verdoving
- Na de beeldvorming is voltooid laat lucht in de kamer.
Controleert bij deze stap:
Controleer hartslag en spiercontracties van de larve door doorgelaten halogeenlicht. Als spieren beginnen aanbestedende het veilig is om de larve te verwijderen uit de beeldvorming kamer. - Maak de kamer van de verdoving apparaat en verwijder deze uit de microscoop. Demonteer voorzichtig de kamer en plaats de larve in gestampte vliegen teelt medium.
- Bewaar de schaal in een couveuse op de juiste temperatuur.
E) Time-serie
- Herhaal de stappen 2-14 tot er voldoende tijd punten zijn verkregen.
Alternatief protocol:
Als de larve is om meer dan een keer worden afgebeeld in een 30 minuten interval kan het praktisch om het te laten in de beeldvorming kamer tot de volgende verdoving tijdstip. Herhaal de stap 7-14 tot er voldoende tijd punten zijn verkregen.
Controleert bij deze stap:
De larve is niet te worden bewaard in de imaging-kamer voor meer dan twee uur per keer, noch is het om onder narcose langer dan 15-20 minuten bij een keer.
Figuur 1 Vergadering van de beeldvorming kamer. (A) Plaats de larve en de plastic spacer op de olie-laag. (B) Plaats een 22 x 22 mm dekglas op de spacer en plaats de plexiglas gids ring in de kamer, naast (C) wordt de positie van de larve met de metalen ring en (D) sluit de kamer. (E) Nu de kamer is klaar om te worden gemonteerd op de microscoop.
Figuur 2 Body-wall spieren in Drosophila larven. Spieren en NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een CD8-GFP-Sh fusie-eiwit 8. De spieren worden als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larve. In (AC) de meest oppervlakkige spieren, 27, wordt getoond, in (KL) de meest interieur spieren, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 micrometer, ΔZ tussen plakken is 2 micrometer.
Figuur 3 Identiteit van het lichaam van wand spieren in Drosophila larven. De identiteit van de spieren in L3 Drosophila larven, segment A3, wordt weergegeven. Spieren en NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een CD8-GFP-Sh fusie-eiwit 8. De spieren worden weergegeven als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larven. In de AC de meest oppervlakkige spieren, 27, is weergegeven, in KL de meest interieur spieren, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 um, ΔZ tussen plakken is 2 micrometer.
Figuur 4 Identiteit van neuromusculaire verbindingen van Drosophila larven. (AD) NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een DGluRIIA-mRFP fusie-eiwit 1. De NMJs worden als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larve. In (AB) de meest oppervlakkige NMJ, 27, is weergegeven, in de CD de meest interieur NMJs, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 um, ΔZ tussen de schijfjes is 5 micrometer. (E) en (F) de identiteit van de oppervlakkige (E) en meer interieur (F) NMJs wordt gegeven als referentie.
Discussion
De gepresenteerde methode is in eerste instantie ontwikkeld voor glutamaat synapsen onderzoek op het lichaam muur spieren van Drosophila melanogaster larven. De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gekenmerkt door een stereotype cyto-architectuur van spieren en neuronen en is daardoor uitermate geschikt voor in vivo beeldvorming. Echter, de beschreven verdoving protocol niet beperkt tot de beeldvorming van de NMJ, de transparantie van de Drosophila larven vergemakkelijkt de aanpassing van de beschreven protocol voor de ontwikkeling van organen studie, migratie van cellen, het transport van axonale cargo en sub-cellulaire reorganisatie binnen de cellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Andreas Schönle, Max-Planck-Instituut voor Biofysische Chemie, Duitsland en David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA voor technisch advies. Wij danken Frank Kotting, European Neuroscience Institute, Göttingen voor de bouw van de beeldvorming kamer en de verdoving apparaat. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Alzheimer Forschung Initiative TMRYZ werd ondersteund door een gemeenschap van de China Scholarship Council, SBH door een gemeenschap van de Graduate School for Cellular and Molecular Neuroscience, Universiteit van Tübingen.
Materials
Reagents:
Equipment:
|
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , Georg-August-University Göttingen. (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
