Viele Infektionen auslösen eine starke CTL-Antwort, aber gelegentlich, die Menge der reagierenden Zellen nicht korrelieren mit der Bekämpfung von Krankheitserregern, 1. Ein Maß für CTL Qualität ist ihre Fähigkeit, spezifisch abtöten 2. CFSE Markierung von Zielzellen kann verwendet werden, um diese CTL-Antwort Qualität zu untersuchen In vivo 3,4.
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Methodenartikel
Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) können verwendet werden, um einfach und schnell Etikett einer Zellpopulation von Interesse für die in vivo Untersuchung. Diese Kennzeichnung ist klassisch benutzt worden, um die Proliferation und Migration zu studieren. In dem hier vorgestellten Verfahren haben wir die Zeitachse nach adoptiven Transfer auf das Überleben und die Tötung von Epitop-spezifischen CFSE markierten Zielzellen 4-6 aussehen verkürzt. Die Höhe der spezifischen Tötung eines CD8 + T-Zell-Klon kann zeigen die Qualität der Antwort, da ihre Menge kann irreführend sein. Spezifischen CD8 + T-Zellen können sich funktionell erschöpft im Laufe der Zeit mit einem Rückgang der Produktion von Zytokinen und Töten 7,8. Auch können bestimmte CD8 + T-Zell-Klonen nicht so gut wie andere zu töten mit unterschiedlichen TCR Besonderheiten 9. Für eine effektive zellvermittelte Immunität (CMI), muss Antigene identifiziert, die produzieren nicht nur eine ausreichende Anzahl von T-Zellen reagieren, sondern auch funktionell robust reagieren T-Zellen. Hier bewerten wir die Prozent-Zell-spezifische Tötung von zwei Peptid-spezifischen T-Zell-Klone in BALB / c Mäusen.
Protokoll
1. Hervorrufen Target-spezifische Effektor CTLs durch Immunisierung (Tag 0)
- Zielsystem: Bevor Sie beginnen, auf eine spezifische Effektor entscheiden. In diesem Beispiel einer klassischen in vivo CTL-Assay verwenden wir ein gereinigtes Peptidimmunisierung spezifische CD8 + T-Zellen auslösen. Das gleiche Peptid wird verwendet, um den syngenen Zielzellen Puls, die Schaffung einer spezifischen Effektor: Target-System. Alternativ können Sie wählen, um ganze Erreger oder Protein benutzen, um Ihre spezifischen Effektoren und Targets zu erhalten.
- Dekontaminieren die Arbeit im Inneren eines Bio Haube, um die Sterilität der Spritzen zu gewährleis....
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Diskussion
Dieser Test kann geändert werden, um die proliferative Kapazität von Zellen, einschließlich klonale Expansion untersucht werden, weil CFSE teilt relativ gleichmäßig auf Nachkommenschaft 10,11. Es ist auch möglich, CFSE Kennzeichnung zu verwenden, um die Zellwanderung 6,12 untersuchen, obwohl es andere Zelle Tracing-Verfahren, die besser geeignet sein kann je nach Hypothese, z. B. Tetramere und Biolumineszenz 13, die ebenfalls mit CFSE Kennzeichnung kombiniert werden kann.
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Wisconsin-Madison gesetzt durchgeführt.
Danksagungen
Ich möchte Bianca Mothe, Carla Oseroff und Marie-France DelGuercio für ihre Einführung in immunologischen Assays und Maus Umgang danken. Die Arbeit im Labor von GA Splitter wird von NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE gewähren 1-U54-AI-057153, und BARD US-3829-06 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mm Glasperlen | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm Zellfilter | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-Well-Platte | Costar | 3799 | |
| Adjulite Inkompletter Freund’s Adjuvans | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, von Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Durchflusszytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes-Glaszerreiber | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Kanüle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, von Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse-Lysierungsmittel | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, von Life Technologies | 11875-093 | |
| Spritze | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
Referenzen
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
