Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Zusammenfassung

Viele Infektionen auslösen eine starke CTL-Antwort, aber gelegentlich, die Menge der reagierenden Zellen nicht korrelieren mit der Bekämpfung von Krankheitserregern, ¹. Ein Maß für CTL Qualität ist ihre Fähigkeit, spezifisch abtöten ². CFSE Markierung von Zielzellen kann verwendet werden, um diese CTL-Antwort Qualität zu untersuchen In vivo 3,4.

Zusammenfassung

Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) können verwendet werden, um einfach und schnell Etikett einer Zellpopulation von Interesse für die in vivo Untersuchung. Diese Kennzeichnung ist klassisch benutzt worden, um die Proliferation und Migration zu studieren. In dem hier vorgestellten Verfahren haben wir die Zeitachse nach adoptiven Transfer auf das Überleben und die Tötung von Epitop-spezifischen CFSE markierten Zielzellen ^4-6 aussehen verkürzt. Die Höhe der spezifischen Tötung eines CD8 + T-Zell-Klon kann zeigen die Qualität der Antwort, da ihre Menge kann irreführend sein. Spezifischen CD8 + T-Zellen können sich funktionell erschöpft im Laufe der Zeit mit einem Rückgang der Produktion von Zytokinen und Töten ^7,8. Auch können bestimmte CD8 + T-Zell-Klonen nicht so gut wie andere zu töten mit unterschiedlichen TCR Besonderheiten ^9. Für eine effektive zellvermittelte Immunität (CMI), muss Antigene identifiziert, die produzieren nicht nur eine ausreichende Anzahl von T-Zellen reagieren, sondern auch funktionell robust reagieren T-Zellen. Hier bewerten wir die Prozent-Zell-spezifische Tötung von zwei Peptid-spezifischen T-Zell-Klone in BALB / c Mäusen.

Protokoll

1. Hervorrufen Target-spezifische Effektor CTLs durch Immunisierung (Tag 0)

1. Zielsystem: Bevor Sie beginnen, auf eine spezifische Effektor entscheiden. In diesem Beispiel einer klassischen in vivo CTL-Assay verwenden wir ein gereinigtes Peptidimmunisierung spezifische CD8 + T-Zellen auslösen. Das gleiche Peptid wird verwendet, um den syngenen Zielzellen Puls, die Schaffung einer spezifischen Effektor: Target-System. Alternativ können Sie wählen, um ganze Erreger oder Protein benutzen, um Ihre spezifischen Effektoren und Targets zu erhalten.
2. Dekontaminieren die Arbeit im Inneren eines Bio Haube, um die Sterilität der Spritzen zu gewährleisten. Bereiten Sie die Peptid-Immunisierung durch das erste Inverkehrbringen 50 ug des gereinigten Peptids in 100 ul 10% DMSO in PBS / Maus in eine 2 ml-Röhrchen enthalten. Als Nächstes fügen Sie eine gleiche Menge an sehr kalten inkomplettem Freund-Adjuvans und bis zu den 0,2 mL-Marke mit 1 mm Perlen zum Mischen. Von diesem Punkt halten Immunogen auf Eis, bis Injektion. Sichere Deckel mit Parafilm.
3. Verwenden Sie einen Bead Beater auf Maximum RPMs, die Emulsion für 3 Minuten mischen, sofort platzieren die Emulsion wieder auf dem Eis nach dem Mischen. Die daraus entstehende Emulsion sollte ähnlich in Konsistenz von Mayonnaise. Lassen Emulsion bei 4 ° C über Nacht sitzen, wenn es die Zeit erlaubt (bis zu einer Woche), Mischen weiter, wenn eine Trennung ist zur Kenntnis genommen.
4. Verwenden Sie eine 1 ml-Spritze und 20 oder 20,5-Gauge-Nadel nach oben zu ziehen Emulsion vorsichtig, um nicht nach oben ziehen jedes Kügelchen (beads sollte größer sein als Gradmesser für Nadel, aber immer noch bewusst sein).
5. Sichere Maus für die subkutane Injektion an der Basis des Schwanzes. Wir verwenden eine modifizierte Kunststoff 50 ml konischen Rohr sicher und schonend fixieren Sie die Maus zur Injektion. Spritzen Sie die Maus mit 0,2 ml Emulsion.

2. Harvesting Zielzellen (Tag 8)

1. Sie müssen naiven syngenen Mäusen für Ihre Zielzellen. Euthanize naive Mäuse nach AAALAC Standards.
2. Desinfizieren Sie mit der Maus durch Sprühen 70% Ethanol, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination von Maus Haare oder andere äußere Verunreinigungen zu minimieren.
3. Mit Dissektion Schere machen kleine snip durch die Haut auf der linken Seite der Maus. Pull Hautlappen an Peritonäalsack und der inneren Organe aufzudecken.
4. Snip durch das Bauchfell, dabei darauf achten, keine Kompromisse bei der zugrunde liegenden Organen. Die Milz liegt in der Nähe der Oberfläche und ähnelt in Farbe, um die Leber (dunkelrot), aber kleiner und Kidneybohnen in Form. Infizierte Mäuse zeigen in der Regel deutlich größeren Milz als nicht infizierte Kontrollen.
5. Ziehen Sie vorsichtig die Milz, wobei darauf zu sanft sein, um nicht die Milz in mehrere Teile zu brechen, um maximale Zellzahlen erholen. Anschließend wird der Milz in eine 15 ml konische mit 10 ml vorbereitet Medien auf Eis. Fahren Sie mit dem restlichen Mäuse.
6. Gießen Sie die Inhalte der 15 mL konischen Rohr (Medien-und Milz) in ein Glas Gewebe Mahlwerk. Grind der Milz mit viel Oberarm Stärke. Wenn alle Gewebe hat seine Farbe verloren Sie können davon ausgehen, dass Sie alle Zellen aus dem Bindegewebe erholt.
7. Gießen Sie die Inhalte der Mühle durch einen 70 um Zelle Filter in einen 50 mL konischen Rohr. Spülen Schleifmaschine mit frischen Medien und gießen Sie durch eine Zelle Sieb.
8. Zentrifuge bei 4 ° C, 1300 rpm für 7 Minuten. Überstand abgießen.
9. Resuspendieren in 10 ml vorbereitet Lysereagenz und bei 37 ° für 7 Minuten.
10. Fügen Sie bis zu 50 ml mit frischem Medium und Zentrifuge, wie oben.
11. Resuspendieren in 50 ml frisches Medium und Zentrifuge, wie oben (Waschschritt). * Hinweis: In dieser Zeit können Sie eine magnetische Zellseparation für einen bestimmten Zelltyp (dh Makrophagen) durchführen, wenn eine reine Zielzellpopulation für den Transfer in Empfängermäuse gewünscht wird. Auch in dieser Zeit könnten Sie führen eine experimentelle Behandlung in die Kultur, um die Auswirkungen dieser Behandlung auf zellspezifische Töten zu studieren.
12. Zählen von Zellen und Platten 1 x 10 ⁷ pro Well in 100 &mgr; l in einer 96-well Rundboden Gewebekulturen behandelte Platte. * Dies ist eine hohe Konzentration von Zellen / Well, sondern weil der Test ist sehr einfach und schnell, wir haben keinen Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen bei dieser Konzentration gesehen.

3. Behandlung und Kennzeichnung von Zielzellen

1. Pulse entsprechenden Zellen und repliziert mit Erreger spezifische Peptid oder irrelevanten Peptid-Steuerung: Add 1 pg / mL Peptid. Inkubation bei 4 ° C für 1,5 Stunden. Bewegen bis 37 ° C Inkubator für die letzten 30 Minuten. Während dieser Zeit bereiten CFSE Reagenz.
2. Bereiten CFSE nach Angaben des Herstellers gelöst und auf eine funktionierende Konzentration zwischen 0,5 und 25 um. Machen Sie "low"-Konzentration 10x niedriger als "hoch" Konzentration CFSE. Zum Beispiel für [low] mit 0,5 ul CFSE zu 10 ml PBS und für [high], mit 5 ul CFSE zu 10 ml PBS. Warm vorbereitet CFSE bis 37 ° C vor der Etikettierung.
3. Entfernen Platte von Zellen aus Inkubator und pEllet in einem Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge bei Raumtemperatur, 1300 RPM für 7 Minuten. Flick zu entfernen Überstand.
4. Die Zellen in entweder [low] oder [hoch] CFSE durch Zugabe von 200 ul der entsprechenden Reagenz in die entsprechenden Wells und Inkubation für 15 Minuten bei 37 ° C.
5. Entfernen Platte von Zellen aus Inkubator wieder Pellet bei Raumtemperatur, 1300 RPM für 7 Minuten. Flick zu entfernen Überstand.
6. Die Zellen in 200 ul / Well erwärmt frisches Medium und Inkubation für 30 Minuten bei 37 ° C.
7. Entfernen Platte von Zellen aus Inkubator und Pellet bei Raumtemperatur, 1300 RPM für 7 Minuten. Flick zu entfernen Überstand.
8. Die Zellen in 100 ul / well PBS.
9. Für adoptiven Transfer, fügen Sie eine gut [low] markierten Zellen zu einem gut [high] markierten Zellen pro Maus. Resultierender Injektion sollte 50% spezifische Ziele und 50% irrelevant Zellen in 0,2 MLS werden.
10. Vergessen Sie nicht beiseite zu legen einige markierte Zellen als Ihr nicht übertragenen Kontrollen während der Datenanalyse und für den Betrieb am Durchflusszytometer zu handeln (siehe Abbildung 1).

4. Adoptiven Transfer

1. Anesthetize zuvor Peptid immunisierten Mäuse (ab part # 1 dieses Protokolls) nach AAALAC Standards.
2. Inject 0,2 ml markierten Zielzellen über retroorbitalen Weg in Empfängermäuse.
3. Warten Sie 6 Stunden oder anderen vorgegebenen optimalen Zeitpunkt vor euthanizing der Empfänger Mäusen.

5. Harvesting markierten Zellen

* Hinweis: Die Schritte 5.1 bis 5,11 sind die gleichen wie die Schritte durch 2,11 2,1

12. Zählen von Zellen und die Platte bei 1 x 10 ⁶ pro Well in 100 ul in 96-Well Rundboden Gewebekulturen behandelte Platte.
13. Fix erholt und nicht übertragenen Zellen durch Zugabe von 100 ul 2% Paraformaldehyd in einer Endkonzentration von 1% Paraformaldehyd in alle Vertiefungen.

6. Durchflusszytometrie und Datenanalyse

1. Run Proben am Durchflusszytometer und die Daten analysieren.

7. Repräsentative Ergebnisse

Eine abnehmende Epitop spezifischen Gipfel auf der resultierende Histogramm ist ein Indikator für die zellspezifische Tötens (Abbildung 1). Verwenden Sie die folgenden Gleichungen (Anwendung in Tabelle 1), um den tatsächlichen Wert der Zelle spezifische Lyse zu bestimmen:
Ratio = Irrelevant Anteil: Epitop-spezifischen Anteil ([low] Höhepunkt: [hoch] peak),
Prozent spezifische Lyse = [1 - (Non-Übertragung Regelverhältnis / Experimental-Verhältnis)] x 100

Abbildung 1. CFSE Profil erholt BALB / c Maus-Splenozyten. Die Zahlen geben den Prozentsatz an Zellen des hohen oder niedrigen CFSE Phänotyp. A) Kontrolle Non-übertragen. Alle [hoch] CFSE Peaks stellen Epitop-spezifischen Zielzellen, während [low] CFSE Gipfel Ziele mit irrelevanten Peptid gepulst darstellen. B) CFSE markierten Zellen aus PBS immunisiert Empfängermaus (Control) erholt. C) CFSE markierten Zellen aus zwei verschiedenen Peptid-spezifische Empfängermäuse erholt, beachten Sie die verminderte Epitop spezifischen Peaks.

Abbildung 2. Grafische Darstellung der analysierten Daten. Drei Datenpunkte für jede Gruppe von Mäusen, PBS, Peptide A und Peptid B gezeigt

Probe	CFSE HOHE% Epitop Pulsed	CFSE LOW% Irrelevant	Verhältnis Low: High	Prozent Epitop-spezifischen Töten
PBS	42,8	57,2	1,34	16,97
PBS	43,1	56,9	1,32	15,94
PBS	44,3	55,7	1,26	11,74
Peptid A	39,7	60,3	1,52	32,56
Peptid A	38,6	61,4	1,59	35,61
Peptid A	40,6	59,4	1,46	29,99
Peptide B	38,7	61,3	1,58	24,68
Peptide B	38,5	61,5	1,60	25,32
Peptide B	39,3	60,7	1,54	22,76
PBS NT-	47,4	52,6
Pep A NT-	49,4	50,6	1,02
Pep B NT-	45,6	54,4	1,19

1,11

Tabelle 1. Analyse von repräsentativen Daten. "NT" ist nicht übertragen.

Diskussion

Dieser Test kann geändert werden, um die proliferative Kapazität von Zellen, einschließlich klonale Expansion untersucht werden, weil CFSE teilt relativ gleichmäßig auf Nachkommenschaft ^10,11. Es ist auch möglich, CFSE Kennzeichnung zu verwenden, um die Zellwanderung ^6,12 untersuchen, obwohl es andere Zelle Tracing-Verfahren, die besser geeignet sein kann je nach Hypothese, z. B. Tetramere und Biolumineszenz ^13, die ebenfalls mit CFSE Kennzeichnung kombiniert werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mm Glasperlen	Biospec Products	11079110
70 μm Zellfilter	BD Biosciences	352350
96-Well-Platte	Costar	3799
Adjulite Inkompletter Freund’s Adjuvans	Pacific Immunology	n/a
DMSO	Sigma-Aldrich	D-5879
FBS	GIBCO, von Life Technologies	16000-077
FC 500 Durchflusszytometer	Beckman Coulter Inc.	n/a
Kontes-Glaszerreiber	Kontes Corp	885300-0015
Mini Beadbeater	Biospec Products	n/a
Kanüle	BD Biosciences	305175
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM992
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	157-8
PBS	GIBCO, von Life Technologies	10010-023
PharmLyse-Lysierungsmittel	BD Biosciences	555899
RPMI 1640	GIBCO, von Life Technologies	11875-093
Spritze	BD Biosciences	309602
Vybrant CFSE Kit	Invitrogen	V12883