Das Screening nach Mutanten mit phänotypischen Defekte ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten biologischen Prozess funktionieren. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Kultur frei lebenden Würmer (z. B. Pristionchus pacificus) Im Labor und zeigen zwei verschiedene Mutagenese-Verfahren, EMS und TMP / UV.
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Methodenartikel
An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren, die Nematoden im Labor und wie man sie mutagenisieren mit zwei alternative Methoden zu halten: Ethylmethansulfonat (EMS) und 4, 5 ', 8-Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV) kombiniert. Nematoden sind leistungsfähige biologische Systeme für genetische Studien wegen ihrer einfachen Körperbau und der Paarung, das aus sich selbst befruchtende Zwitter und Männchen, die hunderte von Nachkommen pro Tier erzeugen kann zusammengesetzt ist. Nematoden sind in Agarplatten mit einem Rasen von Bakterien erhalten und kann leicht von einer Platte zur anderen mit einem Pick übertragen werden. EMS ist ein Alkylierungsmittel häufig verwendet, um Punktmutationen und kleine Deletionen induzieren, während TMP / UV hauptsächlich induziert Löschungen. Je nach Art der Nematoden eingesetzt werden Konzentrationen von EMS und TMP müssen optimiert werden. Zur Isolierung rezessive Mutationen des Nematoden Pristionchus pacificus wurden die Tiere der F2-Generation visuell auf Phänotypen gescreent. Zur Veranschaulichung dieser Methoden, mutagenisierten wir Würmer und suchte Unkoordinierte (UNC), Dumpy (dpy) und Trafo (Tra) Mutanten.
Protokoll
Teil 1: Vorbereiten Nematoden Nährmedien (NGM) Petrischalen
Experimentelle Nematoden wie C. elegans und P. pacificus sind in der Regel im Labor auf 6 cm Petrischalen mit Nematode Growth Medium (NGM) 1 kultiviert. Würmer sind bei 20 ° C gehalten, können aber bei unterschiedlichen Temperaturen (zwischen 4 ° C - 25 ° C) bebrütet werden, abhängig von der Nematoden und experimentelles Design. Zur Vorbereitung Platten mit NGM haben Standard sterile Techniken verwendet werden, um Pilz-und Bakterienbefall zu verhindern. Es folgt das Protokoll zur NGM Platten vorbereiten:
- Wiegen Sie 15 g Agar, 2,4 g NaCl, 2 ....
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Diskussion
Mutagenese ist eine weithin angewandte Technik für genetische Studien in verschiedenen experimentellen Modell-Organismen. Mutagenese-Experimente werden häufig verwendet, um die Funktion eines Gens 2 zu identifizieren. Die Mutagenese hier beschriebenen Verfahren können nicht nur für P. verwendet werden pacificus, sondern auch für C. elegans und anderen verwandten Nematoden. Hier beschreiben wir zwei Methoden, EMS und TMP / UV-Mutagenese.
EMS ist eine Chem.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NSF gewähren IOB # 0615996 gefördert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
