Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Zusammenfassung

Für viele Zwecke ist der Anbau von Maus-Embryonen ex vivo als organotypischen Schnitten wünschenswert. Zum Beispiel verwenden wir eine transgene Maus-Linie (tauGFP), in dem die verbesserte Version des grün fluoreszierenden Protein (EGFP) exklusiv in allen Neuronen des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems ¹ ist ausgedrückt, so dass die Möglichkeit, beide Filme die Innervation das Vorderbein und diesen Prozess mit pharmakologischen und genetischen Techniken ² zu manipulieren. Die wichtigsten Parameter für die erfolgreiche Kultivierung solcher Scheiben Kulturen ist die Methode, mit der die Scheiben sind vorbereitet. Nach umfangreichen Tests von einer Vielzahl von Methoden, die wir gefunden haben, dass ein Vibratom die bestmögliche Gerät, um die Embryonen, so dass sie routinemäßig in einer Kultur, die Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehreren Tagen und vor allem zeigt, Ergebnis Scheibe ist, entwickelt sich in einem Alter, -spezifischen Art und Weise. Für Mitte der Schwangerschaft Embryonen, schließt dies die normale Folge der Spinalnerven aus dem Rückenmark und Spinalganglien, um ihre Ziele in der Peripherie und die richtige Bestimmung des Skelett-und Muskelgewebe.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode für die Verarbeitung von ganzen Embryonen embryonale Tag (E) E10 bis E12 in 300 bis 400 Mikrometer Scheiben für den Anbau in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator, der für Studium kann bis zu zwei Tage nach slice Vorbereitung. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Verwendung eines Vibratom jedem Agarose eingebettete Embryo in Scheiben schneiden. Dies ist durch den Anbau der Scheiben auf Millicell Kultur Membran-Einsätze auf ein kleines Volumen Medium platziert, wodurch eine Schnittstelle Kultur Technik gefolgt. Ein Wurf mit einem Durchschnitt von 7 Embryonen routinemäßig produziert mindestens 14 Scheiben (2-3 Scheiben von dem Vorderbein Region pro Embryo), das leicht variiert je nach Alter der Embryonen sowie die Dicke der Scheiben. Über 80% der kultivierten Scheiben zeigen Nerven Auswuchs, der througout der Anzucht ² gemessen werden kann. Repräsentative Ergebnisse mit dem tauGFP Mauslinie demonstriert.

Protokoll

Teil 1: Vorbereitung für das Schneiden und Kultivieren.

1. Bereiten 10-cm-Zellkulturplatten mit Slicing (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) und 3-cm Millicell-CM 0,4-um Kultur Membran-Einsätze und halten in Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Hitze bis 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und lassen Sie ihn auf Heizplatte, so dass es bei etwa 37 ° C bleibt
3. Füllen Sie 10-cm bakteriologischen Petrischalen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 KH ₂ PO ₄₎ und auf Eis stellen.
4. S....

Diskussion

In einem umfassenden Vergleich von Methoden zur embryonalen Scheibe Kulturen der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen (E10 - E12) vorzubereiten, haben wir beobachtet, dass eine Vibratom ohne Frage stellt die zuverlässigsten Ergebnisse sowohl in Bezug auf die allgemeine Rentabilität der Kulturen und die Reproduzierbarkeit der den Nerv Auswuchs Muster. Im Gegensatz dazu bereit Scheiben mit einem McIlwain Gewebe Chopper ³ erwies sich als völlig lebensfähig. Wir hatten ursprünglich eine Guillotine-Methode

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HBSS 10x	GIBCO, von Life Technologies	14180
Präparationswerkzeuge	Fine Science Tools	verschiedene
L.M.P.-Agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann-Papier	Whatman, GE Healthcare	3030917
Verkürzte, feuerpolierte Pipetten
DMEM	GIBCO, von Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, von Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, von Life Technologies	15140
L-Glutamin 100x	GIBCO, von Life Technologies	25030
Vibratom	Microm International	HM 650 V
Fluoreszenzmikroskop	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM-Einlagen	EMD Millipore	PICMORG 50
10-cm-Kulturschalen	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Rasierklingen	Thermo Fisher Scientific, Inc.	keine
Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glukose	Sigma-Aldrich	G7021
x4-Objektiv	Olympus Corporation	PL-Serie
x10-Objektiv	Olympus Corporation	UPLFL –PH-Serie
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD-Kamera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Ausstattung für beheizte Kammer	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 und Inkubator S #11531171