Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Zusammenfassung

Für viele Zwecke ist der Anbau von Maus-Embryonen ex vivo als organotypischen Schnitten wünschenswert. Zum Beispiel verwenden wir eine transgene Maus-Linie (tauGFP), in dem die verbesserte Version des grün fluoreszierenden Protein (EGFP) exklusiv in allen Neuronen des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems ¹ ist ausgedrückt, so dass die Möglichkeit, beide Filme die Innervation das Vorderbein und diesen Prozess mit pharmakologischen und genetischen Techniken ² zu manipulieren. Die wichtigsten Parameter für die erfolgreiche Kultivierung solcher Scheiben Kulturen ist die Methode, mit der die Scheiben sind vorbereitet. Nach umfangreichen Tests von einer Vielzahl von Methoden, die wir gefunden haben, dass ein Vibratom die bestmögliche Gerät, um die Embryonen, so dass sie routinemäßig in einer Kultur, die Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehreren Tagen und vor allem zeigt, Ergebnis Scheibe ist, entwickelt sich in einem Alter, -spezifischen Art und Weise. Für Mitte der Schwangerschaft Embryonen, schließt dies die normale Folge der Spinalnerven aus dem Rückenmark und Spinalganglien, um ihre Ziele in der Peripherie und die richtige Bestimmung des Skelett-und Muskelgewebe.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode für die Verarbeitung von ganzen Embryonen embryonale Tag (E) E10 bis E12 in 300 bis 400 Mikrometer Scheiben für den Anbau in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator, der für Studium kann bis zu zwei Tage nach slice Vorbereitung. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Verwendung eines Vibratom jedem Agarose eingebettete Embryo in Scheiben schneiden. Dies ist durch den Anbau der Scheiben auf Millicell Kultur Membran-Einsätze auf ein kleines Volumen Medium platziert, wodurch eine Schnittstelle Kultur Technik gefolgt. Ein Wurf mit einem Durchschnitt von 7 Embryonen routinemäßig produziert mindestens 14 Scheiben (2-3 Scheiben von dem Vorderbein Region pro Embryo), das leicht variiert je nach Alter der Embryonen sowie die Dicke der Scheiben. Über 80% der kultivierten Scheiben zeigen Nerven Auswuchs, der througout der Anzucht ² gemessen werden kann. Repräsentative Ergebnisse mit dem tauGFP Mauslinie demonstriert.

Protokoll

Teil 1: Vorbereitung für das Schneiden und Kultivieren.

1. Bereiten 10-cm-Zellkulturplatten mit Slicing (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) und 3-cm Millicell-CM 0,4-um Kultur Membran-Einsätze und halten in Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Hitze bis 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und lassen Sie ihn auf Heizplatte, so dass es bei etwa 37 ° C bleibt
3. Füllen Sie 10-cm bakteriologischen Petrischalen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 KH ₂ PO ₄₎ und auf Eis stellen.
4. Set up Mikrotom Kühleinrichtung oder sicherzustellen, dass Pufferwanne und Kühlelemente in den Gefrierschrank zur Vorkühlung es gespeichert.

Teil 2: Embryo-Einbettung.

1. Dissect Embryonen aus der Gebärmutter und untersuchen sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop für GFP-Expression zu überprüfen.
2. Legen Embryonen auf eine invertierte 10-cm-Petrischale und orientieren sie mit Whatman Papierstreifen übermäßigen PBS zu entfernen.
3. Bewerben Agarose auf den Embryo, um es in dieser Position zu fixieren. Lassen Agarose erstarren.
4. Begrenzen Sie die Umgebung des Embryos durch Schneiden mit einer Rasierklinge.
5. Drehen Sie die eingebettete Embryo auf der anderen Seite.
6. Wenden Sie zusätzliche Agarose an embryonalen Gewebe, um sicherzustellen, dass der Embryo vollständig eingebettet ist.
7. Bereiten Agarose-Block mit sauberen Kanten und montieren auf Vibratom Spannfutter mit Loctite 406, einem speziellen Klebstoff ähnlich wie bei "Krazy Glue".

Teil 3: Slicing Verfahren.

1. Richten Sie die vorgekühlte Pufferwanne und dem Kühlelement.
2. Legen Sie das Futter mit der geklebten Gewebe und fügen 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +-freiem} HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml Penicillin / Streptomycin) bis bedeckt.
3. Insert und beheben vorgereinigt (70% Ethanol) Mikrotomklinge.
4. Bereiten Sie 350 bis 450 mu m Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit verkürzten Glas Pasteurpipetten in Zellkulturplatten auf Eis gehalten.
5. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Agarose von jeder Scheibe und Transfer zum Kultur-Membranen Millicell. Über 4 Scheiben können auf einer Membran in einer 10-cm Gewebekultur Platte mit 6 ml Kulturmedium gefüllt kultiviert werden.
6. Inkubieren Scheiben bei 37 ° C und 5% CO ₂ (Kulturmedium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Wenn man Zeitraffer-Imaging-Serie führt man sollte immer das Volumen des Mediums konstant. Im Falle der zeitlich Imaging-Serie für eine kurze Zeitspanne genügt es, das Medium zu verlassen, wie es ist. Für längere Zeiträume Kultur Veränderungen nach 12-20 Stunden empfohlen.

Teil 4: Imaging Spinalnerven Auswuchs am Mikroskop.

1. Image Spinalnerven Platzierung einer 10-cm Gewebekulturplatte, mit Millicell Kultur Membranen mit Scheiben, im Rahmen eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop.
2. Beschriften Sie die Ausrichtung der Millicell Kultur Membranen auf Mikroskop-Bühne, um richtig zu positionieren in den nächsten Bildgebung Zeitpunkt.
3. Bild Spinalnerven Auswuchs mit 4x (numerische Apertur [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) oder 20x (NA 0,5) Ziele.

Abbildung 1 zeigt ein Imaging-Serie Darstellung der Spinalnerven Auswuchs während 20 Stunden Kultur mit 4x und 10x Ziele.

Abbildung 1 Imaging Reihe von Spinalnerven Auswuchs in eine transversale Scheibe einer homozygoten tauGPF Embryo. * = Motoneuronen des ventralen Rückenmark, Pfeil = DRG. Die Rückenflosse (D)-ventralen (V) Achse der Scheibe angezeigt. Scalebars: 200 um.

Diskussion

In einem umfassenden Vergleich von Methoden zur embryonalen Scheibe Kulturen der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen (E10 - E12) vorzubereiten, haben wir beobachtet, dass eine Vibratom ohne Frage stellt die zuverlässigsten Ergebnisse sowohl in Bezug auf die allgemeine Rentabilität der Kulturen und die Reproduzierbarkeit der den Nerv Auswuchs Muster. Im Gegensatz dazu bereit Scheiben mit einem McIlwain Gewebe Chopper ³ erwies sich als völlig lebensfähig. Wir hatten ursprünglich eine Guillotine-Methode

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HBSS 10x	GIBCO, von Life Technologies	14180
Präparationswerkzeuge	Fine Science Tools	verschiedene
L.M.P.-Agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann-Papier	Whatman, GE Healthcare	3030917
Verkürzte, feuerpolierte Pipetten
DMEM	GIBCO, von Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, von Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, von Life Technologies	15140
L-Glutamin 100x	GIBCO, von Life Technologies	25030
Vibratom	Microm International	HM 650 V
Fluoreszenzmikroskop	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM-Einlagen	EMD Millipore	PICMORG 50
10-cm-Kulturschalen	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Rasierklingen	Thermo Fisher Scientific, Inc.	keine
Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glukose	Sigma-Aldrich	G7021
x4-Objektiv	Olympus Corporation	PL-Serie
x10-Objektiv	Olympus Corporation	UPLFL –PH-Serie
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD-Kamera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Ausstattung für beheizte Kammer	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 und Inkubator S #11531171