Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Zusammenfassung

Zuverlässige Methode für hocheffiziente In-vitro- Ausdruck und die anschließende elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T).

Zusammenfassung

Die in vitro-Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) ist eine weit verbreitete Forschungsstrategie. HEK-293T-Zellen müssen auf Deckgläschen bei niedrig genug Dichte ausplattiert werden, so dass sie nicht in Kontakt miteinander sind, um für die elektrophysiologische Ableitung ohne verwirrende Effekte durch mit benachbarten Zellen wenden können. Transfizierte Kanäle müssen auch mit hoher Effizienz zum Ausdruck an der Plasmamembran für whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung von nachweisbaren Ströme über Geräuschpegel. Heterologe Ionenkanäle benötigen oft lange Inkubationszeiten bei 28 ° C nach der Transfektion, um eine ausreichende Membran-Expression zu erreichen, aber es gibt immer mehr Verluste von Zell-Adhäsions-und Deckglas Membranstabilität bei dieser Temperatur. Um dieses Problem zu umgehen, entwickelten wir eine optimierte Strategie zur Transfektion und Platte HEK-293T-Zellen. Diese Methode erfordert, dass die Zellen auf einem relativ hohen Konfluenz transfiziert werden, und bei 28 ° C für unterschiedliche Inkubationszeiten nach der Transfektion für eine angemessene Ionenkanal-Protein-Expression zu ermöglichen. Die transfizierten Zellen werden dann auf Deckgläschen ausplattiert und bei 37 ° C für mehrere Stunden, die für starre Bindung an die Zelle Deckgläser und Membran Restabilisierung ermöglicht. Die Zellen können kurz nach der Beschichtung erfasst werden, oder kann bis 28 ° C für weitere Inkubation übertragen werden. Wir finden, dass die anfängliche Inkubation bei 28 ° C, nach der Transfektion, aber vor dem Ausplattieren Schlüssel für die effiziente Expression heterologer Ionenkanäle, die normalerweise nicht exprimieren auch an der Plasmamembran ist. Positiv transfiziert werden kultivierten Zellen durch Co-Ausdruck eGFP oder eGFP identifiziert ausgedrückt aus einer bicistronischen Vektor (zB pIRES2-EGFP) mit dem rekombinanten Ionenkanal cDNA kurz vor einer internen Ribosomeneintrittsstelle und eine eGFP kodierende Sequenz. Whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert spezialisierte Einrichtungen, sowie die Crafting aus poliertem Aufnahme Elektroden und L-förmigen Masseelektroden aus Borosilikatglas. Drug-Delivery zur Pharmakologie von Ionenkanälen Studie kann direkt Mikropipettierung Drogen in die Aufnahme Gericht oder durch Verwendung Mikroperfusion oder Abflussrohre Systeme, die ununterbrochene Ströme von Drogen-Lösung produzieren über aufgezeichneten Zellen erreicht werden.

Protokoll

1. Cell Culture

1. Mit 6 mL Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich) Humane embryonale Nierenzellen 293T-Zellen (HEK-293T, Invitrogen) sind in adhärente Monolayer in entlüftet 25cm ² Flaschen (; CELLSTAR Greiner Bio-One Zellkultur behandelt) gewachsen, das mit 10 % v / v fötales Rinderserum (FBS; Sigma Aldrich), 1% Natriumpyruvat und 250 ug / ml Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO _2).
   
   Die Zellen werden in CO _{2-Inkubatoren} inkubiert (5% CO ₂₎ gesetzt, um entweder 37 ° C oder 28 ° C. Alle Arbeiten mit Zellen in einer Sterilbank durchgeführt.
   
   
2. Die Zellen ....

Diskussion

Die Möglichkeit, whole-cell Ströme unter Verwendung der beschriebenen Protokolle und Lösungen Datensatz zeigt, dass die Transfektion erfolgreich war und dass die gewünschte Spannung Ionenkanälen oder Ionenkanal-Komplexe vorhanden sind, mit erheblichen Mengen an der Zellmembran. Sollten die Zellen positiv transfiziert werden (dh grün fluoreszierend), aber nicht beschreibbare Strömungen, zusätzliche Zeit bei 28 ° C erforderlich, um für die Kanal-Protein richtig verpackt werden und in die Zellmembran ermöglichen kann. Beac.......

Materialien

Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentar
pIRES2-EGFP-Plasmid	Clontech	6029-1
Kreis Deckgläser	Fisher Scientific	12-545-80	Circles Nr. 1 bis 0,13 bis 0,17 mm dick, Größe: 12mm
Verstärker	Axon Instruments	Axopatch 200B oder 700B Multiclamp
Data Acquisition System	Axon Instruments	Digidata 1440A
Elektrophysiologie Software	Axon Instruments	pClamp10.1
Pipette Manipulatoren	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
Epifluoreszenz inversen Mikroskop	Zeiss Kanada	Axiovert 40 CFL
Headstage	Axon Instruments	CV-7B
Headstage Elektrodenhalter	Axon Instruments	1-HL-U
Mikroelektroden-Halter für Masseelektrode	World Precision Instruments	MEH3RF 15
Elektrophysiologie Kapillarrohre	Sutter Instrument Co.	BF-150-86 bis 15	Borosilikatglas mit Filament, OD 1,5 mm, OD 0.86mm, 15cm lang
Flaming / Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Micropipette Feuer Polierer	Narishige	Micro Forge MF-830
Micro Medikament Perfusionssystem	AutoMate Scientific	SmartSquirt8 Valvelink8.2
Drug Perfusionssystem	AutoMate Scientific	Valvelink8.2 mit Teflon-Ventile