Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt die Methodik auf die chemotaktische Reaktion von Leukozyten an spezifische Liganden zu bestimmen und zu identifizieren Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren auf der Zelloberfläche und zytosolischen Proteinen unter Verwendung von Live Cell Imaging Verfahren.

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gehören zu den sieben Transmembran-Protein-Familie und vermitteln die Transduktion der extrazellulären Signale an intrazelluläre Reaktionen. GPCRs Kontrolle vielfältigen biologischen Funktionen wie Chemotaxis, intrazellulären Calcium-Freisetzung, Genregulation in einem Liganden abhängigen Art und Weise über heterotrimeren G-Proteine ^​​1-2. Ligandenbindung induziert eine Reihe von Konformationsänderungen führt zu einer Aktivierung der heterotrimeren G-Proteine, die Ebenen der Botenstoffe wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), Inositol-Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG) modulieren. Einhergehend mit Aktivierung des Rezeptors Ligandenbindung löst auch eine Reihe von Veranstaltungen an den Rezeptor Signalgebung über Desensibilisierung, Zwangsverwaltung und / oder Internalisierung zu dämpfen. Die Desensibilisierung Prozess der GPCRs erfolgt über Rezeptor-Phosphorylierung durch G-Protein-Rezeptor-Kinasen (GRKs) und die anschließende Bindung von β-arrestins ^3. β-arrestins sind cytosolische Proteine ​​und Translokation zur Membran auf GPCR-Aktivierung, die Bindung an phosphorylierte Rezeptoren (meistens) gibt es durch die Erleichterung des Rezeptor-Internalisierung ^4-6.

Leukotrien B ₄ (LTB ₄₎ ist ein pro-inflammatorischen Lipidmolekül aus Arachidonsäureweg und vermittelt seine Aktionen über GPCRs, LTB _4-Rezeptor 1 (BLT1, ein Rezeptor mit hoher Affinität) abgeleitet und LTB _4-Rezeptor-2 (BLT2, ein Rezeptor mit niedriger Affinität ) ^7-9. Die LTB _4-BLT1 Weg hat sich gezeigt, kritisch zu sein in mehrere entzündliche Erkrankungen wie Asthma, Arthritis und Atherosklerose ^10-17. Das vorliegende Papier beschreibt die Methoden entwickelt, um LTB _4-induzierte Leukozyten-Migration und die Wechselwirkungen von BLT1 mit β-Arrestin und Rezeptor-Translokation in lebenden Zellen mit Mikroskopie-Techniken ^18-19 überwachen.

Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus C57BL / 6 Mäuse wurden isoliert und kultiviert wie zuvor ^20-21 beschrieben. Diese Zellen wurden im Live Cell Imaging-Methoden getestet, um LTB ₄ induzierten Zellmigration zu demonstrieren. Der menschliche BLT1 wurde mit rot fluoreszierendes Protein (RFP-BLT1) am C-Terminus und β-arrestin1 mit grün fluoreszierende Protein (β-arr-GFP) markiert markiert und transfizierten der beiden Plasmide in Rat Basophile Leukomia (RBL-2H3)-Zelllinien ^18-19. Die Kinetik der Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen und Lokalisation wurden unter Verwendung lebender Zellen Video-Mikroskopie. Die Methoden in der aktuellen Papier beschreiben die Verwendung von mikroskopischen Techniken, um die funktionellen Antworten von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in lebenden Zellen zu untersuchen. Das vorliegende Papier beschreibt auch die Verwendung von Metamorph Software, um die Fluoreszenz-Intensitäten zu quantifizieren, um die Kinetik der Rezeptor und cytosolische Protein-Interaktionen zu bestimmen.

Protokoll

Methodik

Beschreibung von Mikroskop

Live Cell Imaging Experimente mit TE-FM Epi-Fluoreszenz-System an Nikon Inverses Mikroskop Eclipse-TE300. Das Mikroskop mit Heiztisch ausgestattet. Ein kühles Snap HQ digital B / W CCD (Roper Scientific) Kamera und LAMDA 10-2 optischen Filter-Wechsler (Sutter Instrument Company) ist Mikroskop angeschlossen. Anregungs-und Emissionswellenlänge mit Filter Räder kontrolliert und gesteuert von Lamba 10-2 Filterrad Controller sollte Sutter Instruments Co. Belichtungszeit 500 ms genug sein, um RFP oder GFP in lebende Zellen. Hardware-Steuerung und Erfassung von Bildern von Metamorph-Sof....

Diskussion

Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion und Wechselwirkungen der Proteine, wie sie in real-time auftreten zu demonstrieren. Die Methoden in diesem Manuskript beschrieben zeigen deutlich, dass LTB ₄ kann eine schnelle Migration von dendritischen Zellen zu induzieren. Diese Methoden erweitern nicht nur die Aspekte der LTB _4-Funktion, um diverse Zelltypen, erlauben sie ähnliche Methoden, um eine Vielzahl von anderen Chemokinen angewendet werden und Prüfung ihrer Wirksamkei.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ratten-basophile Leukämiezelllinie (RBL-2H3) oder HEK293-Zellen.	ATCC	CRL-2256
Delbecco’s modifiziertes Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen	11995
Phenolrotfreies RPMI oder DMEM	Invitrogen	11835-030
Fötales Rinderserum	Invitrogen	16000-044
L-Glutamin (200 mM)	Invitrogen	25030
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)	Invitrogen	15140
Trypsin, 0,05 % (1X) mit EDTA 4Na, flüssig	Invitrogen	25300
HEPES (1 M)	Invitrogen	15630
35-mm-Sterilglasdeckglas-Boden-Fluoroschalen (0,17 mm dick) (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Sterile Elektroporationsküvette (0,4 cm Elektrodenabstand) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
Gene Pulser II Elektroporator	Bio-Rad
TE-FM Epi-Fluoreszenz-System an Nikon Invertiertes Mikroskop Eclipse TE300 angeschlossen	Nikon Instruments
Metamorph-Software	Universal Imaging
Vertikaler Mikropipettenzug	Narishige International
Mikro-Forge M-900	Narishige International
Hydraulischer Mikromanipulator MO-188NE	Narishige International
Grobmanueller Manipulator, MN-188NE	Narishige International
cDNA-Konstrukte:
cDNA des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, markiert mit rotem Fluoreszenzprotein am C-Terminus (hBLT1-RFP)	Jala et al 2005
cDNA des zytosolischen Proteins, markiert mit GFP (β-Arrestin1-GFP in der vorliegenden Studie).	Jala et al 2005