Dies ist ein Beispiel dafür, wie biologische Membranen verstanden mit elektrischen Modelle. Wir zeigen auch Verfahren zur Erfassung Aktionspotentiale aus dem Bauchmark der Krebse für Schüler orientiert Labors.
Methodenartikel
Modellierung biologischer Membranen mit Leiterplatten und Messung elektrischer Signale in Axone: Schülerlabor Übungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dies ist eine Demonstration, wie elektrische Modelle können verwendet werden, um biologische Membranen zu charakterisieren. Diese Übung führt auch biophysikalische Terminologie in Elektrophysiologie. Das gleiche Gerät ist in der Membran-Modell als zu leben Zubereitungen verwendet. Einige Eigenschaften eines isolierten Nervenstrang untersucht: Nervenaktionspotentiale, Rekrutierung von Neuronen und Reaktionsfähigkeit der Nervenstrang auf Umweltfaktoren.
Protokoll
1. EINFÜHRUNG
1.1) Hintergrund
Grundlegende Kenntnisse über elektrische Schaltkreise sind ein wertvolles Hilfsmittel, um viele Aspekte der physiologischen Experimentation und Theorie zu verstehen und zu veranschaulichen. Diese Übung soll Sie mit einigen allgemeinen Prinzipien vertraut machen, die Spannungsquellen, elektrischen Widerstand und elektrische Kapazität betreffen. Diese einführenden Konzepte bilden die Grundlage für das Verständnis von Phänomenen wie der synaptischen Übertragung und der Ausbreitung elektrischer Signale entlang einer Nervenfaser.
Eine Warnung: In standardmäßigen, alltäglichen elektrischen Schaltkreisen, die aus Metalldrähten und Widerständen bestehen, wird der STROM von Elektronen getragen, die eine negative Ladung besitzen. In biologischen Systemen wird der Strom von IONEN getragen, die eine oder mehrere positive oder negative Ladungen aufweisen können. Nach Konvention fließt der Strom von positiv nach negativ (obwohl sich Elektronen natürlich tatsächlich in die entgegengesetzte Richtung bewegen).
Die Bestandteile der Schaltung stellen die elektrischen Eigenschaften lebender Gewebe und in manchen Fällen auch die unbelebter Objekte (wie Elektroden) dar, die an deren Untersuchung beteiligt sind.
Notieren Sie während der Bearbeitung der Übung die Ergebnisse und Berechnungen.
1.2) Allgemeine Grundsätze
Die grundlegenden Eigenschaften elektrischer Schaltkreise, in denen Gleichstrom fließt, werden durch das Ohmsche Gesetz beschrieben
V = IR
Dabei ist V = Spannung in Volt (V)
I = Stromstärke in Ampere (A)
R = Widerstand in Ohm (Ω)
Dieses Gesetz beschreibt die Potenziale, die mit Elektroden in Nervenzellen beobachtet werden. Zunächst werden wir das Ohmsche Gesetz und seine Anwendung in biologischen Materialien demonstrieren.
1.3) Materialien
| Artikel | Menge |
| Steckbrett | 1 |
| Widerstände: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Kondensatoren: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Kabel | 12 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab-Ausgangsleitungen | 1 |
| PowerLab-Eingangsleitungen | 1 |
| Spannungsmesser (mit Strommessfunktion) | 1 |
Schlüssel zur Widerstandscodierung
| Farbe | Ziffer |
| Schwarz | 0 |
| Braun | 1 |
| Rot | 2 |
| Orange | 3 |
| Gelb | 4 |
| Grün | 5 |
| Blau | 6 |
| Violett | 7 |
| Grau | 8 |
| Weiß | 9 |
| Silber | 10 % Toleranz |
| Gold | 5 % Toleranz |
1st Band – 1st Ziffer
2nd Band – 2nd Ziffer
3rd Band – Anzahl der Nullen
4th Band – Toleranz
Abbildung 1: Systemaufbau. Computer, Steckplatte und Power Lab mit Ausgangsstimulator.
Das PowerLab-System (PowerLab-Schnittstelle von AD Instruments, Australien) dient in diesem Experiment als Spannungsquelle. Schließen Sie das USB-Kabel des PowerLab an den Computer an, schalten Sie das PowerLab ein und öffnen Sie das Programm LabChart über das Desktop-Symbol. Wählen Sie „Neue Datei“. Ein Fenster mit mehreren Aufnahmekanälen erscheint. Wählen Sie oben „Einrichten“ und klicken Sie auf „Kanaleinstellungen“. Verringern Sie in der linken unteren Ecke des Fensters die Anzahl der Kanäle auf 1; ändern Sie bei Kanal 1 die Messbereichseinstellung auf 5 V. Verbinden Sie das Stimulationskabel mit den beiden Mini-Hakenleitungen mit den Ausgangsports am PowerLab: Schließen Sie das rote Verbindungskabel an den positiven Ausgangs-Port und das schwarze Verbindungskabel an den negativen Ausgangs-Port an. Als Nächstes müssen die Leistungsabgabe, Frequenz und Impulsdauer des PowerLab angepasst werden. Wählen Sie hierzu „Einrichten“ und dann „Stimulator-Panel“. Für den ersten Teil des Experiments werden lange Impulse von 1,5 V benötigt. Stellen Sie daher die Amplitude auf 0,75 V ein; dies ergibt eine Spannungsspitze von 1,5 V (das PowerLab sendet eine Spannung aus, die zwischen +0,75 V und -0,75 V wechselt). Stellen Sie die Frequenz (0,5 Hz) und die Impulsdauer (1 s) ein.
Abbildung 2: Schaltplan für Steckbrett. Die farbigen Streifen an den Seiten sind jeweils farbweise als eine Einheit miteinander verbunden. Die beiden horizontalen Spalten in der Mitte sind jeweils pro Hälfte und Zeile untereinander verbunden, überqueren jedoch weder die Mittellinie noch sind sie mit den seitlichen Streifen verbunden. Jede mittlere Zeile ist unabhängig von der nächsten Zeile.
Bei Verwendung einer Steckplatine gibt es zwei Spalten auf jeder Seite, die für die Ein- und Ausgangsleitungen verwendet werden. Positiv ist in der Regel mit der rechten positiven Spalte verbunden, bei der alle Felder in der Spalte miteinander verbunden sind. Der negative Anschluss wird auf der gegenüberliegenden Seite der Steckplatine angeschlossen, wo ebenfalls alle Felder einer Spalte miteinander verbunden sind. In der Mitte zwischen den beiden Spaltensätzen befinden sich mehrere Reihen mit jeweils fünf Zellen, von denen jede unabhängig von den anderen ist. Alle Zellen einer Fünferreihe sind miteinander verbunden, aber von anderen Reihen isoliert. Siehe Abbildung 2. Die hervorgehobenen Bereiche zeigen, welche Teile der Steckplatine miteinander verbunden sind. Ein hilfreiches Video zur Verwendung von Steckplatinen ist online unter http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related verfügbar.
Übung 1
Verwenden Sie das Ohmsche Gesetz, um den durch den folgenden Stromkreis fließenden STROM zu berechnen:
Strom (Netzwerk 1): ________________ A
Übung 2
Messen Sie die Spannung am Widerstand, den Widerstandswert des Widerstands und den Strom, der durch die obige Schaltung (Netzwerk 1) fließt.
Abbildung 3: Wavetek Meterman Voltmeter.
Stellen Sie Netzwerk 1 auf der Steckplatine mit einem 1500 Ω-Widerstand nach; die PowerLab dient als Spannungsquelle (1,5 V). Spannungs-, Strom- und Widerstandsmessungen erfolgen mit dem Voltmeter. Um genaue Daten zu erhalten, müssen sowohl die rote als auch die schwarze Sonde des Voltmeters mit blankem Draht im Stromkreis in Kontakt stehen. Zudem sollte der Drehregler auf Gleichspannung eingestellt werden, im Bereich, der für die jeweilige experimentelle Anordnung geeignet ist. Für die Spannungsmessung berühren Sie beide Sonden des Voltmeters an den beiden Enden des Widerstands an. Wenn Sie den Widerstand des Widerstands messen (nicht den Spannungsabfall), TRENNE die Spannungsquelle ab und berühren Sie erneut beide Sonden am Widerstand an. Um den Strom zu messen, muss das Voltmeter in REIHE im Stromkreis geschaltet sein; beachten Sie, dass die rote und schwarze Sonde korrekt in Bezug auf die Stromrichtung ausgerichtet sein müssen.
Spannung (Netzwerk 1): ________________V
Widerstand (Netzwerk 1): ________________Ω
Stromstärke (Netzwerk 1): ________________A
Messen Sie nun mit dem Power Lab die Spannung über Netzwerk 2 (identisch zu Netzwerk 1, jedoch auf einer Steckplatine), so wie Sie es zuvor mit dem Voltmeter getan haben. Trennen Sie das Voltmeter und schließen Sie die Leitungen der Spannungsmesssonde mit den roten und schwarzen Klemmen an. Gehen Sie anschließend dazu, mit dem Cursor auf „Channel 1“ (rechte Seite des Bildschirms) zu klicken. Klicken Sie und wechseln Sie zu „input amplifier“. Klicken Sie dann im Feld auf die Schaltfläche „differential“ und stellen Sie den Bereich auf 5 V ein. Klicken Sie auf „OK“, um die Änderungen zu speichern.
Klicken Sie auf „Start“ (rechte untere Ecke), um Daten zu erfassen. Man kann jederzeit anhalten, um die Spannungsabweichungen zu messen. Um die erfasste Spannung zu messen, klicken Sie auf „Stop“ und verwenden Sie den „M“-Cursor (linke untere Ecke), indem Sie ihn per Ziehen auf die Basislinie bewegen. Verwenden Sie anschließend den freien Cursor, um die Spitze der Spannungskurve anzusteuern und die Amplitude zu messen. Lesen Sie die Spannungsänderung (ΔV) ab und notieren Sie die Daten auf Papier. Sie können die Ergebnisse mit dem separaten Voltmeter überprüfen.
1.4) Widerstand und Leitwert in Serie
Prinzip des Spannungsteilers: Der Spannungsabfall über die Gesamtheit aller in Reihe geschalteten Widerstände entspricht der Spannung der Quelle. Die Spannung an jedem einzelnen Widerstand hängt vom Anteil des Gesamtwiderstands ab, den dieser Widerstand darstellt. Daher:
Ein Widerstandspaar teilt eine Spannung im Verhältnis ihrer individuellen Widerstände.
Übung 3
Berechnen Sie den Spannungsabfall an jedem Widerstand in Netzwerk 3. Überprüfen Sie Ihre Berechnungen, indem Sie die tatsächliche Spannung mit Ihrem Voltmeter und der Power-Lab-Software messen, während die 1,5-V-Quelle angeschlossen ist.
NETZWERK 3. Verwenden Sie die beiden oben angegebenen Widerstände.
| Berechnet: | Gemessen: |
| Spannung (an R1):_______V | Spannung (an R1): ________________V |
| Spannung (an R2):_______V | Spannung (an R2): ________________V |
1,5) Biologische Anwendung des Probenmaterials:
Die unterschiedlichen elektrischen Eigenschaften des Zellinneren und der äußeren Lösung einer aktiven Nervenzelle stellen ein Beispiel für einen Spannungsteiler dar. Diese biologische Schaltung kann durch Ableitungen mit externen Elektroden untersucht werden. Der aktive Bereich der Nervenzelle, an dem Ionen eintreten, wirkt als Spannungsquelle; der Strom fließt von diesem Bereich entlang des Zellinneren und kehrt durch die äußere Lösung zurück. Somit fließt zwischen zwei Punkten der Membran, die sich im Potential unterscheiden, notwendigerweise ein Strom, der im Inneren der Faser ebenso groß ist wie außerhalb; da der Widerstand im Inneren größer ist als im Äußeren, tritt hier der größte Spannungsabfall auf.
Betrachten Sie das System und seinen Ersatzschaltplan (Abbildung 4: A. und B.):
Ersatzschaltplan:
Abbildung 4: A (oben). Elektrischer Stromfluss durch eine biologische Zellmembran. B (unten). Äquivalenter elektrischer Schaltkreis. Die Spannungsquelle (120 mV) ist die transmembrane Spannung, die durch das Aktionspotential der Nervenzelle erzeugt wird.
Hinweis: R0 und Ri sind aufgrund der Position der Spannungsquelle tatsächlich in Reihe geschaltet (nicht parallel). Eine alternative Darstellung des Schaltkreises sieht wie folgt aus:
Abbildung 5: Alternativer äquivalenter elektrischer Schaltkreis zu Abbildung 4A.
Übung 4.
Gegeben sei:
Vm, Potential über die Membran = 120 mV
Ri, Widerstand der inneren Flüssigkeit = 106 Ω
R0, Widerstand der äußeren Flüssigkeit = 104 Ω
Berechnen Sie V0, das Potential zwischen den Elektroden A und B.
V0: ________________V
Übung 5.
Messen Sie mithilfe von Netzwerk 4 (siehe unten) die Spannungen an jedem Widerstand (R0 und Ri).
NETZWERK 4. Schließen Sie 4,7-KΩ- und 10-KΩ-Widerstände in Reihe mit der 1,5-V-Quelle an:
Messen Sie die Spannungen mit Ihrem Voltmeter.
Spannung (an R0): ________________ V
Spannung (an Ri): ________________ V
NETZWERK 5: Gleich wie Netzwerk 4, außer dass R0 = 1 K Ω beträgt.
Beachten Sie, dass beim Netzwerk 5 der externe Widerstand viel niedriger ist (vergleichbar mit einer großen Menge Flüssigkeit oder inaktiven Gewebes, die die Elektroden überbrückt); daher ist es wichtig, Nerven in Luft oder unter isolierendem Öl aufzunehmen, um den externen Widerstand zu erhöhen.
Spannung (über R0): ________________V
Spannung (über Ri): ________________V
1,6) Widerstand und Leitwert in Serie und parallel
Beispiel für eine biologische Anwendung:
Ein gutes Beispiel für in Reihe und parallel geschaltete Widerstände ist die elektrische Anordnung einer chemisch übertragenden Synapse. Die elektrische Übertragung ist über die meisten Synapsen hinweg aufgrund der Kurzschlusswirkung der synaptischen Spalte nicht möglich. Beachten Sie jedoch, dass dieser Kurzschluss wahrscheinlich notwendig ist, um die Entstehung eines großen Potentials über die präsynaptische Membran mit der damit verbundenen Transmitterfreisetzung zu ermöglichen.
Abbildung 6: Modell des elektrochemischen Flusses durch eine Synapse.
Beachten Sie, dass in lebendem Gewebe erhebliche elektrische Widerstände an Membranen und in eingeschränkten extrazellulären Räumen entstehen. Relativ große Flüssigkeitsräume, wie das Zytoplasma der Zellen oder die Badelösungen, stellen dagegen keine nennenswerten Widerstände dar.
Übung 6.
Netzwerk 6 (siehe oben und Schalttafel) ist ein Analogon einer chemisch übertragenden Synapse. Bei elektrisch übertragenden Synapsen wird die synaptische Spalte (Shunt-Widerstand Rs) eliminiert, und der Strom fließt direkt von der präsynaptischen zur postsynaptischen Zelle über Rm1 und Rm2 und dann über Rm3. Die Dämpfung des Netzwerks kann leicht mit verschiedenen Widerstandswerten gemessen werden, um Veränderungen in unterschiedlichen Synapsen zu veranschaulichen. Schließen Sie Ihr PowerLab mit 1,5 V (d. h. 0,75-Volt-Einstellung) an.
- Messen Sie die Potentialdifferenz (PD) an jedem Widerstand im vorgegebenen Netzwerk mit dem Multimeter. Notieren Sie die Werte der Widerstände. Achten Sie besonders auf die PD an Rm3 (die Membran der postsynaptischen Zelle). Spannung: ________________V
- Ersetzen Sie den 330-Ω-Widerstand an Rs durch einen 330-kΩ-Widerstand. Messen Sie die PD an Rm3.
- Behalten Sie nun Rs bei 330 kΩ und ersetzen Sie den 330-kΩ-Widerstand an Rm2 durch einen 33-kΩ-Widerstand. Messen Sie die PD an Rm3. Spannung: ________________V
- Behalten Sie nun Rs bei 330 kΩ und Rm2 bei 33 kΩ bei und ersetzen Sie den 22-kΩ-Widerstand an Rm1 durch einen 220-Ω-Widerstand. Messen Sie die PD an Rm3. Spannung: ________________V
Übung 7
Ein Beispiel für ein reihen-paralleles Widerstandsnetzwerk ergibt sich bei der Betrachtung der Kabeleigenschaften einer Nerven- oder Muskelzelle. Die LÄNGENKONSTANTE einer Faser ist jene Distanz, über die sich eine PD über der Membran auf 37 % ihres ursprünglichen Werts verringert. Die Dämpfung beruht darauf, dass die inneren und äußeren Widerstände der Flüssigkeiten auf beiden Seiten der Membran durch den (verhältnismäßig hohen) transversalen Membranwiderstand abgeleitet werden. Der Wert des Widerstands begrenzt die Signalübertragung entlang des Axons einer Nervenzelle. Die Längenkonstante entspricht 1/e, gemessen bei einem exponentiellen Abfall. dE/dT = –E/RC; wobei E die Spannungsdifferenz, R der Widerstand und C die Kapazität ist. Oder in einer anderen Form: E = Eoexp(–t/RC); wobei Eo die Ausgangsspannung und t die Zeit in Sekunden ist. RC wird auch als Tau (τ), die Zeitkonstante, bezeichnet.
Unter der Annahme, dass der Widerstand des äußeren Fluids im Vergleich zu den intrazellulären und Membranwiderständen vernachlässigbar ist, können die passiven resistiven Eigenschaften der Membran durch folgende Schaltung dargestellt werden:
Abbildung 7: Übertragung des Netzwerks 7 auf einen Steckbrettaufbau.
Legen Sie eine Spannung an einem Ende von Netzwerk 7 zwischen A und B an. Verwenden Sie einen Stimulator und wählen Sie einen Impuls mit einer Dauer von 1 s, einer Amplitude von 1 V (auf 0,5 V eingestellt) und einer Frequenz von 0,75 Hz. Schließen Sie das Voltmeter nacheinander an jeden „Membran“-Widerstand an und notieren Sie die Spannungsdifferenz (PD) an diesem Widerstand. Halten Sie ein Ende der Voltmeter-Sonde fest an (A-Anschluss, rot), während das andere Ende nacheinander an den Positionen 1–5 bewegt wird. Tragen Sie jeden Wert in einem Diagramm der Spannungsdifferenz über die „Distanz“ von der Quelle auf, wobei die Membranwiderstände jeweils um eine Einheitsdistanz voneinander entfernt sind. Bestimmen Sie anhand Ihres Diagramms die Längenkonstante dieses Stromkreises. 
Diagramm der Längenkonstante von Netzwerk 7:______________
Die Wirkung einer Zunahme des transversalen Membranwiderstands, wie sie bei einem Myelinscheath auftritt, oder einer Abnahme des longitudinalen inneren Widerstands der Faser, verbunden mit einer Zunahme des Faserdurchmessers, besteht in einer Veränderung der Längenkonstanten. Die Werte der Widerstände entsprechen nicht genau denen in einem Nervenaxon, sondern sind etwa proportional. Ebenso ist der „Einheitsabstand“ im Modell im Vergleich zu einer echten Nervenzelle erheblich vergrößert dargestellt.
1,7) Kapazität
Kondensatoren speichern Ladung. Wenn eine Spannung über einen Widerstand an einen Kondensator angelegt wird, fließt Strom in den Kondensator, und die PD (Potentialdifferenz) über dem Kondensator steigt exponentiell mit der Zeit in Richtung der Quell-PD an; der zeitliche Verlauf dieser Spannungsänderung hängt von der angelegten Spannung, der Kapazität und dem Serienwiderstand ab. Ein ähnlicher, aber invertierter zeitlicher Verlauf wird beim Entladen eines Kondensators beobachtet.
Schließen Sie den Eingang dieses einfachen Widerstands-Kondensator-(RC-)Netzwerks an Ihren Stimulator an den Punkten A und B an. Verwenden Sie 1 V (auf 0,5 V eingestellt) Impulse mit einer Dauer von 1 s und einer Frequenz von 0,75 Hz. Außerdem muss die Aufzeichnungsrate auf 20 K/Sek. eingestellt werden (rechte Seite des Bedienfelds). Schließen Sie Ihre Eingangsklemmen des PowerLab über den Kondensator an. Nehmen Sie einige Sekunden auf und stoppen Sie dann. Verwenden Sie das Zoom-Fenster, um die Anstiegszeit eines der Rechteckimpulse zu vergrößern. Das Hineinzoomen muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um die Spur auszudehnen. Messen Sie die Anstiegszeit von der Basislinie bis zum oberen Ende der Spannungsspur, kurz bevor diese sich stabilisiert. Beobachten Sie den zeitlichen Verlauf der Potentialänderung sowie die Verzerrung der Rechteckimpulse. Beobachten Sie die Auswirkung, wenn der 10 μF-Kondensator durch einen 0,1 μF-Kondensator ersetzt wird. Indem Sie die Spannungsprobe Ihres PowerLab über den Widerstand anschließen, können Sie den zeitlichen Verlauf des Stromflusses durch die Schaltung beobachten. Nehmen Sie nur wenige Impulse auf und stoppen Sie dann, um zu messen. Verwenden Sie den „M“-Cursor, um zur Basislinie vor dem Anstieg zu bewegen, und den freien Cursor dorthin, wo die Spannung beginnt, sich zu stabilisieren.
Das letzte Beispiel beinhaltet sowohl resistive als auch kapazitive Komponenten. Die passiven Kabeleigenschaften von Nerven- und Muskelzellen werden durch ähnliche Elemente bestimmt, die sich aus den Eigenschaften der Zellmembran ergeben. Neben einem transversalen Membranwiderstand ist in der Zelle auch eine Membrankapazität vorhanden, die auf den elektrischen Eigenschaften der Zellmembran beruht. Dies wirkt sich darauf aus, den zeitlichen Verlauf der Ausbreitung elektrotonischer Potentiale zu beeinflussen.
Beispiel:
Dieses Netzwerk kann aus Netzwerk 7 konstruiert werden, indem die erforderlichen Kondensatoren parallel zu den Membranwiderständen (Rm) angebracht werden.
Übung 8.
Schließen Sie an Netzwerk 7 die 10 μF-Kondensatoren an. Verwenden Sie 1 s lange, 1 V (0,5 V-Einstellung) und 0,75 Hz Impulse vom Stimulator, der an den Punkten A und B angeschlossen werden sollte, und beobachten Sie die Spannungsänderungen an jedem Membranwiderstand. Unter der Annahme, dass die „Schwellenspannung“ (die Spannung, bei der ein Aktionspotential in einer Nervenzelle erzeugt wird) 0,2 V beträgt, messen Sie die Zeit, die benötigt wird, bis die Spannung an jedem Membranwiderstand den Schwellenwert erreicht. Hier bedeutet Schwellenwert den Potentialwert, bei dem in einer lebenden Zelle ein Aktionspotential ausgelöst werden kann. Tragen Sie Ihre Ergebnisse als Zeit über der „Distanz“ auf.
Abbildung 8: Übertragung von Netzwerk 9 auf die Steckplatine.
Diagramm zu Abbildung 8.
Simulieren Sie die Wirkung einer Abnahme der Membrankapazität, die durch eine Zunahme der Dicke der Myelinscheide verursacht wird, indem Sie die Kondensatoren durch kleinere mit 0,1 µF ersetzen. Achten Sie auf die Änderung der Zeit, die benötigt wird, um die Schwelle an einem ausgewählten Widerstand zu erreichen. Überlagern Sie die Daten im selben Diagramm mit den größeren Kondensatoren.
Im Fall einer Muskelmembran kann man eine erhöhte Kapazität aufgrund der vergrößerten Oberfläche durch die assoziierten T-Tubuli annehmen, was zu einer größeren Membrankapazität im Vergleich zu einem Neuron führt. Kleinere Kondensatoren können verwendet werden, um die verringerte Kapazität zu veranschaulichen, die durch die Hinzufügung von Myelin zu einem unmyelinisierten Nervenaxon entsteht. Der wichtigste Aspekt, der hier vermittelt werden soll, ist, dass die elektrische Kapazität proportional zur Oberfläche ist und umgekehrt proportional zur Dicke der dielektrischen Schicht (Myelin), die die „Platten“ oder Speicherflächen des Kondensators voneinander trennt.
Die an einem Modellkreislauf gezeigten Eigenschaften werden auch in lebenden Präparaten beobachtet. Zellen unterscheiden sich jedoch in ihren Eigenschaften, wie beispielsweise der Membranleckage und dem axialen Widerstand. Einige Zellen erzeugen keine Aktionspotentiale. Ein Aktionspotential entsteht jedoch, wenn ein Signal über einige Millimeter weitergeleitet werden muss, da die passiven elektrischen Eigenschaften der Zellen Signale über diese Distanz dämpfen. In der nächsten Versuchsreihe wird die Ableitung von Aktionspotentialen veranschaulicht.
1.8) Fragen an die Studierenden
- Welche normalen Werte für die Längskonstante gibt es bei Neuronen und Muskelzellen?
- Was passiert, wenn eine Membran einen niedrigen Membranwiderstand aufweist: Würde sich die Zeitkonstante (Zeit bis zum Erreichen von 63 % des Endwerts) ändern? Falls ja, wie würde sie sich bei einem niedrigeren Membranwiderstand verändern? Wie lautet die allgemeine mathematische Formel für die Zeitkonstante (Tau)?
- Warum können größere Axone, wie das Riesenaxon des Tintenfischs, elektrische Signale schneller leiten als kleinere Axone in derselben Tintenfischpräparation?
2. LEITUNGSEIGENSCHAFTEN VON NERVENZELLEN
2.1) Von einer Versuchsplatte zu lebenden Zellen
Die in den Übungen mit der Leiterplatte gezeigten passiven Eigenschaften sind auch in lebenden Zellen messbar; diese passiven Eigenschaften können jedoch kompliziert zu isolieren sein, wenn sie zusammen mit Aktionspotentialen in Nervenzellen auftreten. Die aktiven Eigenschaften des Neurons bestehen in seiner Fähigkeit, ein Ruhepotential der Membran aufrechtzuerhalten, Aktionspotentiale zu erzeugen und diese entlang eines Membranabschnitts zu regenerieren.
Der elektrische Fluss entlang eines Nervenstrangs kann innerhalb einzelner Neuronen sowie von einem Neuron zum nächsten regenerativ sein. Im ventralen Nervenstrang der Krebse (VNC) kommunizieren einige Neuronen über septierte (d. h. elektrische) Synapsen. Wie in den früheren Übungen mit dem Steckbrett gezeigt wurde, kann die Veränderung des Widerstands die Leitung elektrischer Signale behindern. Dies ist vergleichbar mit der Veränderung des Stromflusses durch elektrische Synapsen im ventralen Nervenstrang.
Die Leitungsgeschwindigkeit und andere Eigenschaften des zusammengesetzten Aktionspotentials im VNC werden in der nächsten Versuchsreihe untersucht. Wir werden zeigen, wie das VNC für Experimente gewonnen wird und wie die Antworten mit Standardgeräten, die für den Einsatz in studentischen Lehrpraktika konzipiert sind, hervorgerufen und gemessen werden können.
2.2) Die Krebsvorbereitung
Das Bauchmark des Flusskrebses eignet sich am besten für dieses Experiment. Das Nervengewebe lässt sich leicht präparieren, und eine Vielzahl von Protokollen, die die Leitung beeinflussen, kann mit dieser Präparation angewendet werden. Bevor Sie mit diesem Experiment beginnen, machen Sie sich mit den unten aufgeführten anatomischen Begriffen des Flusskrebses vertraut:
Abbildung 9. Allgemeines anatomisches Diagramm des Flusskrebses.
Modifiziert nach: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Grundlagen der Leitung in einem Nerv
Das Bauchmark des Flusskrebses hat die Funktion, Signale zu übertragen, die Fluchtreaktionen wie die Schwanzflickbewegung auslösen. Für dieses Experiment werden Aufnahmen vom gesamten intakten Nervenstrang durchgeführt. Die einzelnen Potentiale jedes Neurons innerhalb des Nervenstrangs summieren sich und erzeugen so das zusammengesetzte Aktionspotential, das die messbaren elektrischen Impulse darstellt, die von der Aufnahmesoftware angezeigt werden. Erlanger, Gasser und Bishop (1924) gehören zu den Pionieren, die zusammengesetzte Aktionspotentiale beschrieben haben. Es werden die Eigenschaften der Refraktärzeit, der Leitungsgeschwindigkeit sowie die neuronalen Wirkungen des Gap-Junction-Hemmers 1-Heptanol oder der Temperatur gezeigt. Das Erlernen der grundlegenden Prinzipien neuronaler Signale trägt zu einem besseren Verständnis der neurologischen Funktion im Allgemeinen bei (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe und Grundfest, 1961).
2.4) Materialien
| Artikel | Menge |
| Großer Flusskrebs (Procambarus clarkii) | 1 |
| Präzisions-Schnittschere | 1 |
| Pinzette | 1 |
| Nervenkammer MLT016/X | 1 |
| Laptop mit Scope-Software | 1 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab-Verstärker | 1 |
| Stimulationsausgangskabel für PowerLab | 1 |
| USB-PowerLab/Computer-Verbindungskabel | 1 |
| Manipulatorstativ mit Saug-Elektrode | 1 |
| Glaspipette mit Birne | 1 |
| Becher mit Flusskrebs-Salzlösung | 1 |
2,5) Methoden
2.5.1) Dissektion
Stellen Sie sicher, dass die Nervenwanne, verschiedene Instrumente und Lösungen vorbereitet sind, bevor Sie eine Krebse dissezieren.
- Wickeln Sie die Krebse in ein feuchtes Papiertuch, um sie zu halten, oder halten Sie den Krebs mit einer Hand so, dass die Scheren (Chelipeden) zwischen Daumen und Zeigefinger liegen.
- Verwenden Sie die andere Hand, um mit einer Schere einen Schnitt durch den Rostrum zwischen den Augenhöhlen zu führen.
- Schneiden Sie vom Schnitt aus nach unten, bis der Kopf vollständig abgetrennt ist.
- Führen Sie am Ansatz des Cephalothorax oberhalb des Abdomens einen Schnitt durch; entfernen Sie den Schwanz. (Falls erforderlich, können die Chelipeden und Laufbeine entfernt werden, um diesen Vorgang zu erleichtern.)
- Entfernen Sie die Schwimmbeine.
- Führen Sie entlang beider Seiten der ventralen Seite des Abdomens einen Schnitt durch. Achten Sie darauf, das tieferliegende Gewebe nicht zu beschädigen.
- Heben Sie den freigelegten Teil des Exoskeletts bis zur Basis des Schwanzfächer an, um den ventralen Nervenstrang freizulegen.
- Entfernen Sie mit der Kante der Pinzette vorsichtig die Spitze des ventralen Nervenstrangs. Achten Sie darauf, den Nervenstrang weder zu dehnen noch zu quetschen. (Alle am Nervenstrang sichtbaren Knoten sind Ganglien des Krebses.)
- Legen Sie den Nervenstrang quer über die Metallstäbe in der Nervenkammer. Es ist unbedingt erforderlich, den ventralen Nervenstrang feucht zu halten. Um dies zu erreichen, geben Sie so viel Krebs-Ringerlösung in die Nervenkammer, dass die Flüssigkeit bis zur Höhe der metallischen Querstäbe reicht. Danach pipettieren Sie so viel Krebs-Ringerlösung heraus, dass der Flüssigkeitspegel gerade die Unterseiten der Stäbe berührt.
Krebs-Ringerlösung (mM: 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2·2H2O; 2,45 MgCl2·6H2O; 5 HEPES, auf pH 7,4 eingestellt) - Sobald der Nerv an Ort und Stelle ist, befestigen Sie das Stimulationskabel mit den beiden Mini-Hakenleitungen an der Nervenkammer. Verbinden Sie die rote, positive Leitung mit einer der äußeren Metallschleifen am Ende des Nervenstrangs; verbinden Sie die schwarze, negative Leitung mit der nächstgelegenen benachbarten Metallschleife, die noch mit dem Nervenstrang in Kontakt steht.
- Positionieren Sie die Saugnadelelektrode im Manipulator nahe dem entgegengesetzten Ende des Nervs.
- Saugen Sie vorsichtig die Spitze des ventralen Nervenstrangs in die Ableitelektrode ein.
2.5.2) Aufnahme
Sobald die Spitze des Nervenstrangs in die Ableitelektrode hineingesaugt wurde, sicherstellen, dass die Elektrode am Messfühler befestigt ist und der Fühler ausreichend geerdet ist. Dies kann einfach erreicht werden, indem das Erdungskabel an den Faradayschen Käfig angeschlossen wird. Die positiven und negativen Drähte der Saug-Elektrode sollten ebenfalls an den entsprechenden Stellen am Fühler befestigt werden. Der Fühler sollte mit dem Differenzverstärker verbunden sein, der wiederum mit dem PowerLab verbunden ist.
Verbinden Sie die elektrischen Kabel der Saugnadelelektrode mit der Kopfstufe. Die Kabel sollten wie folgt angeschlossen werden: rot (positiv) oben links, grün (Masse) in der Mitte und schwarz (negativ) unten. Dies ist in Abbildung 10 für die unten dargestellte Kopfstufe veranschaulicht. Der Massekabel kann einfach in das Salzlösungsbad gelegt werden. Somit wird ein Kabel der Saugnadelelektrode mit dem +- und das andere mit dem --Eingang verbunden. Es spielt keine Rolle, welches der beiden Kabel der Saugnadelelektrode mit dem +- oder --Eingang verbunden wird.
Abbildung 10: Eingänge für die Kopfphase
Die Einstellungen für den Verstärker lauten wie folgt:
| STEUERUNG | EINSTELLUNG |
| Hochpass | DC |
| Sperrfilter | AUS |
| Tiefpass | 20kHz |
| Kapazitätskompensation | Im Gegenuhrzeigersinn |
| DC-Offset-Fein- und -Grobkopplung | Im Gegenuhrzeigersinn |
| DC-Offset (+OFF) | AUS |
| Verstärkungsregler | 50 |
| Eingang (DIFF MONO GND) | DIFF |
| MODUS (STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | AUS |
Schließen Sie das mitgelieferte USB-Kabel an die Rückseite des PowerLab und an die Computerbuchse an. Öffnen Sie die Scope-Software auf dem Computerdesktop. Wählen Sie oben rechts auf dem Bildschirm „Channel 2“ aus und schalten Sie es aus. Passen Sie den Bildschirm so an, dass nur Channel 1 angezeigt wird, indem Sie den Balken in der Mitte des Bildschirms nach unten schieben. Klicken Sie anschließend oben rechts auf dem Bildschirm auf den „Input Amplifier“ für Kanal 1. Wählen Sie Folgendes aus:
| STEUERUNG | EINSTELLUNG |
| BEREICH | 500 mV |
| AC | AUSGEWÄHLT |
| TIEFPASS | AUS |
| EINZELN | AUSGEWÄHLT |
| INVERTIEREN | AUSGEWÄHLT |
Als Nächstes klicken Sie erneut unter „Einrichten“ auf „Abtasten“. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Bildschirm im Feld mit der Bezeichnung „Sweep“ Folgendes aus:
| STEUERUNG | EINSTELLUNG |
| MODUS | MULTIPEL |
| PROBE | 100 DURCHLÄUFE |
| QUELLE | BENUTZER |
| VERZÖGERUNG | 0 SEKUNDEN |
Wählen Sie abschließend im Reiter „Einrichten“ die Option „Stimulator“ aus. Klicken Sie auf das Kästchen, um „Isolierte Stimulation“ zu deaktivieren. Wählen Sie die folgenden Einstellungen:
| STEUERUNG | EINSTELLUNG |
| MODUS | MULTIPEL |
| VERZÖGERUNG | 5 ms |
| Dauer | 1 ms |
| IMPULS(E) | 2 |
| INTERVALL | 15 ms |
| BEREICH | 5 V |
| AMPLITUDE | 0,5 |
Siehe „Time Base“ im rechten Bereich. Ändern Sie „Sample“ auf 1024 und „Time“ auf 200 ms.
Abbildung 11: Zwei zusammengesetzte Aktionspotentiale mit einem Intervall von 15 msec zwischen den Reizen, aufgezeichnet mit der Scope-Software.
Übung 1.
Wählen Sie die Schaltfläche „Start“ unten links auf dem Bildschirm aus. Bei den oben genannten Einstellungen sollte ein deutlich abgegrenztes zusammengesetztes Aktionspotential im Datenerfassungsfeld „Scope“ erscheinen (Abbildung 11). Skizzieren Sie die allgemeine Form des Aktionspotentials im folgenden Diagramm (Abbildung 12):
Abbildung 12: Leeres Diagramm zur Skizzierung der Form des zusammengesetzten Aktionspotentials.
Verringern Sie langsam die Spannung mithilfe des Registers oben links auf dem Bildschirm. Das Aktionspotential sollte in seiner Amplitude kleiner werden, bis sein charakteristisches Wellenmuster ebenfalls verschwindet. Die Verringerung der Spannung reduziert die Anzahl der Neuronen, die zur Auslösung des zusammengesetzten Aktionspotentials rekrutiert werden. Wahrscheinlich werden die größeren Axone bereits bei niedrigeren Spannungen rekrutiert, und diese leiten schneller, weshalb sie tendenziell zuerst im zusammengesetzten Aktionspotential erscheinen. Erhöhen Sie die Spannung schrittweise, um den entgegengesetzten Effekt zu beobachten; je mehr Neuronen rekrutiert werden, desto größer wird die Welle des zusammengesetzten Aktionspotentials. Diese Übung verdeutlicht, dass einzelne Neuronen unterschiedliche Schwellenwerte für die Erzeugung eines Aktionspotentials besitzen. Wenn das zusammengesetzte Aktionspotential bei weiter steigender Stimulierungsspannung nicht mehr zunimmt, wurden alle Neuronen rekrutiert; auf dem Computerbildschirm sollten zwei deutlich getrennte Peaks in der Aktionspotentialwelle sichtbar sein.
Übung 2.
Nach der Untersuchung der Rekrutierung von Neuronen und des resultierenden zusammengesetzten Aktionspotentials beobachten Sie den Effekt der Refraktärzeit. Dies kann durch zwei kurz nacheinander gegebene Reize erfolgen, wobei das interstimulative Intervall variiert wird. Anschließend wird beobachtet, bei welchem interstimulativen Intervall das durch den zweiten Reiz hervorgerufene zusammengesetzte Aktionspotential im Vergleich zum ersten zusammengesetzten Aktionspotential eine verminderte Amplitude aufweist. Ändern Sie die Verzögerung zwischen den Impulsen mithilfe des Tabs in der linken oberen Ecke des Bildschirms. Verkürzen Sie die Verzögerung weiter, bis das zweite zusammengesetzte Aktionspotential nicht mehr ausgelöst werden kann. Die Zeit zwischen den Impulsen, bei der kein zweites Aktionspotential mehr ausgelöst wird, wird als absolute Refraktärzeit bezeichnet. Die Zeit zwischen dem Ende der absoluten Refraktärzeit und dem Zeitpunkt, zu dem ein zweiter Reiz ein Aktionspotential voller Amplitude erzeugt, wird als relative Refraktärzeit bezeichnet. Geben Sie eine Schätzung der absoluten und relativen Refraktärzeiten in den dafür vorgesehenen Feldern an.
Absolute Refraktärzeit: ___________________
Relative Refraktärzeit: ___________________
2.5.3) Messung der Leitungsgeschwindigkeit
Messen Sie mit einem Millimetermaßstab den Abstand zwischen dem stimulierenden Draht, der der Ableitelektrode am nächsten liegt, und der Ableitelektrode. Messen Sie anhand der aufgezeichneten Spur die Zeit bis zu den verschiedenen Peaks der Ereignisse im zusammengesetzten Potential, um die Leitungsgeschwindigkeit der verschiedenen elektrischen Signale erfassen zu können. Wandeln Sie den Abstand von Millimeter in Meter und die Zeit von Millisekunden in Sekunden um, um die Einheit Meter pro Sekunde zu erhalten.
1ste Wellenform-Leitungsgeschwindigkeit: __________________
2te Wellenform-Leitungsgeschwindigkeit: __________________
3te Wellenform-Leitungsgeschwindigkeit: __________________
4te Wellenform-Leitungsgeschwindigkeit: __________________
2.5.4) Manipulation der Gap-Junctions und/oder der Leitungsgeschwindigkeit
Als Nächstes untersuchen Sie die Eigenschaften eines neuronalen Inhibitors. Die Entkopplungswirkung von Heptanol wurde erstmals in septierten Axonen von Krebsen (d. h. Nexusstelle) von Johnston et al. (1980) beschrieben. Diese Wirkung im Zusammenhang mit der elektrischen Kommunikation wurde bald in verschiedenen Wirbeltier- und Wirbellosensystemen bestätigt (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Um die Rolle der elektrischen Kommunikation in diesem ventralen Nervenstrang zu verstehen, kann ein Salin mit (1 mM) 1-Heptanol verwendet werden, um die Nexusstellen zu entkoppeln. Mit einer Glaspipette spülen Sie die gesamte Nervenbahn mit einer Heptanol-Lösung aus. Beobachten Sie die Änderung, die von der Scope-Aufzeichnungssoftware erfasst wird, und fassen Sie diese zusammen. (Achten Sie auf die Veränderung der Wellenform und darauf, ob sich die Leitungsgeschwindigkeit der Wellenformen verändert hat.) Alternativ kann anstelle von 1-Heptanol kalte Salzlösung mit Eis abgekühlt werden und jegliche Veränderung der Wellenform oder der Leitungsgeschwindigkeit der Wellenformen überwacht werden.
Diskussion
Unser Ziel in der Online-Video-Präsentation und das Papier ist zu zeigen, dass die biophysikalischen Eigenschaften von Zellen, können zum Teil als elektrische Schaltungen modelliert werden. Darüber hinaus, mit Live-Nervengewebe, die relativ leicht zu erhalten ist, sind grundlegende Prinzipien der Leitgeschwindigkeit Refraktärzeiten und elektrophysiologische Aufnahmetechniken für Bachelor-Student Labors mit bescheidenen Investitionen von Geräten möglich. Die Themen und grundlegende Paradigmen vorgestellt leicht für die Anforderungen der verschiedenen Kurse geändert werden.
Wartung von Flusskrebsen und ihren Reichtum macht sie attraktiver Modelle für Schüler bestimmte Experimente. Krustentier ventrale Nervenstränge sind in der Regel robust und behalten physiologische Integrität in einer minimalen Kochsalzlösung für Stunden, was ausreichend für eine 3-stündige Schülerlabor ist.
Da einige der großen Axone in den VNC des Krebses über Gap Junctions, zusätzliche Experimente auf ihren Beitrag durchgeführt werden können, und andere Eigenschaften als gefunden in der Standard-Frosch Ischiasnerv Vorbereitung nachgewiesen werden können, sind verbunden. Der Ischiasnerv ist ein klassisches Modell für die Bewältigung Verbindung Aktionspotentiale und Leitungseigenschaften. Es könnte sogar eine interessante Vergleichsversuch für Studenten Leitungseigenschaften vergleichen, Axon Rekrutierung und Refraktärzeiten zwischen diesen beiden Präparaten werden.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Experimente wurden von einem Labor Handbuch, das in einem Kurs verwendet wurde, orchestriert von Dr. HL Atwood, am Institut für Zoologie, Universität Toronto geändert. Die Übungen wurden auch genutzt und modifiziert aus einem Handbuch, das für "6 th INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC Neuroscience" produziert wurde und an der Korea University, Seoul, South Korea im Jahr 1993 (Cooper et al., 1993) statt. Die aktuellen Änderungen waren erforderlich, um Geräte gemeinsam nutzen zu Tag Schüler gerichtet Labors an verschiedenen Universitäten präsentieren. Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts & Sciences.
Materialien
Leiterplatte
- Electronics unten für die breadboard Experimente aufgeführt sind, können bei einem lokalen Elektronik-Geschäft wie Radio Shack erhältlich.
- Bread Board, Widerstände, Kondensatoren, Batterien und Drähte, die als Knotenpunkte für das Steckbrett dienen kann, wie in den Experimenten dargestellt.
- Eine gemeinsame Voltmeter (Wavetek Meterman Voltmeter)
- A / D-Karte für Online-Aufzeichnung auf einem Computer. Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab/4s Schnittstelle (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope.
Physiologie Experimente
- Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
- Standard-Krebse Kochsalzlösung: Geändert von Van Harreveld-Lösung (1936). (In mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Alle Kochsalzlösung Chemikalien wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten.
- Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette, feine Schere, Messer Messerhalter, # 26002-20 Insektennadeln (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten)
- Ein Nerv Kammer Schale (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) auf die Nerven zu behalten. Die Drähte, die mit den Nerven Kammer Gericht kommen kann verwendet werden, um die Nerven zu stimulieren.
- Ein Saugelektrode wird verwendet, um die Signale aufzuzeichnen.
- Der Manipulator oder einer Klammer an einem Ring stehen auch als Halterung für die Saug-Elektrode dienen.
- Faraday-Käfig
- Präpariermikroskop
- High Intensity Illuminator (Lichtquelle)
- Mikroskop-Plattform
- AC / DC Differenzverstärker (AM Systems Inc. Modell 3000)
- PowerLab 26T (AD Instruments)
- Extrazelluläre Verstärker (AD Instruments)
- LabChart 7 (ADI Instruments)
- Dissecting Werkzeuge
- Ein Ring stehen und Klemme als Halterung für die Aufnahme Saugelektrode dienen
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
