Wir bieten Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für whole-cell Patch-Clamp-Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in peripheren mononukleären Zellen gewonnenen humanen T-Lymphozyten.
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Methodenartikel
Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In T-Lymphozyten, die Erschöpfung des Ca 2 + aus den intrazellulären Ca 2 + zu speichern führt zur Aktivierung von plasmalemmal Ca 2 +-Kanäle, genannt Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Kanäle. CRAC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zell-Proliferation und Genexpression. Abnormal CRAC-Kanal-Funktion in T-Zellen hat schwere kombinierte Immundefizienz und Autoimmunerkrankungen 1, 2 in Verbindung gebracht worden. Studieren CRAC-Kanal-Funktion in menschlichen T-Zellen können gemeinsam neue molekulare Regulationsmechanismen normalen Immunantwort und lösen die Ursachen verwandter Krankheiten beim Menschen. Elektrophysiologischen Ableitungen von Membran-Ströme liefern die genaue Beurteilung der funktionellen Kanal Eigenschaften und ihre Regulation. Elektrophysiologische Beurteilung der CRAC Kanal Ströme in Jurkat T-Zellen, einer menschlichen Leukämie-T-Zell-Linie, zuerst durchgeführt wurde mehr als 20 Jahren 3, jedoch bleibt CRAC Strommessungen in normalen menschlichen T-Zellen eine anspruchsvolle Aufgabe. Die Schwierigkeiten bei der Aufnahme CRAC Kanal Ströme in normalen T-Zellen werden durch die Tatsache, dass Blut gewonnene T-Lymphozyten viel kleiner als Jurkat T-Zellen und sind daher die endogene whole-cell CRAC Ströme sehr gering in der Amplitude zusammengesetzt sind. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, das wir regelmäßig verwenden, um die Ca 2 + Rekord oder Na +-Ströme über CRAC Kanäle in Ruhe menschlichen T-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden isoliert. Die hier beschriebene Methode wurde von den Verfahren für die Aufnahme der CRAC Ströme in Jurkat T-Zellen und aktivierten humanen T-Zellen 4-8 verwendet hat.
Protokoll
1. Vorbereitung der Ruhe menschlichen T-Lymphozyten
- Mit RosetteSep Menschliche T-Zell-Anreicherung Cocktail und RosetteSep Density Medium, reinigen T-Zellen aus menschlichen Blutproben nach den Anweisungen des Herstellers. Die daraus resultierende Zellpopulation sollte 95% CD3 + ruhende T-Zellen. Wir reinigen menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blutproben von gesunden Freiwilligen in Übereinstimmung mit dem Protokoll von der UC Davis Internal Review Board genehmigt gesammelt.
- Nach der Isolierung resuspendieren ruhende T-Zellen bei einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium RPMI-1640 Medium mit Glut....
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Diskussion
Die elektrophysiologische Untersuchung von CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Zellen ist eine anspruchsvolle Aufgabe, da die endogene CRAC Stromamplitude in diesen Zellen ist wegen der geringen Größe der Zellen (die ruhende humane T-Zell-Durchmesser liegt im Bereich von 5-8 um). Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zuverlässig zu erfassen CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen isoliert. Diese Technologie ermöglicht es uns, die Physiologie und funkt.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir sind dankbar, dass das Department of Physiology and Membrane Biology, University of California Davis, die uns mit Einrichtungen und ein ausgezeichnetes Umfeld für die Studien an Ionenkanälen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Koktail zur Anreicherung menschlicher T-Zellen mit RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep-Dichtemittel | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-1640-Medium mit Glutamin/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetalkalbserum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100×-Lösung) | Invitrogen | 35050 | |
| Vitaminlösung für RPMI 1640 (100×) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Aminosäurenlösung für 1640 (50×) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inosit-trisphosphat | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysin-Hydrobromid | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanchlorid | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Halbleiterschutzlack | Dow Corning | ||
| 63-500 Serie Hochleistungs-Vibrationsisolations-Labortisch | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 Patch-Clamp-Verstärker mit Kopfverstärker | HEKA Instruments | ||
| Mikromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 inverses Mikroskop mit 40×-Ölimmersionsobjektiv | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows-Computer | Dell | ||
| Pulse-Software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch-Pipettenzieher | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borsilikatglas mit Filament (Außendurchmesser: 1,5 mm und Innendurchmesser: 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Mikroföhn | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silikon-O-Ringe | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Deckgläser 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referenzen
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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Nachdrucke und Genehmigungen
