Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.
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Methodenartikel
Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Isolierung von Immunzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) während der Infektion, Trauma, Autoimmunität oder Neurodegeneration zu infiltrieren, ist oft erforderlich, um ihren Phänotyp und Effektor-Funktionen zu definieren. Histochemische Ansätze sind instrumental, um die Lage der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundenen ZNS-Pathologie zu analysieren. Allerdings sind in-situ Histochemie und Immunfluoreszenzfärbung Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die zu einem einzigen Zeitpunkt genutzt werden, um Immunzellen Subtypen in einem bestimmten Gewebe zu charakterisieren können, beschränkt. Daher sind histologische Ansätze in Verbindung mit Immun-Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie kritischen vollständig zu charakterisieren die Zusammensetzung der lokalen ZNS Infiltration. Dieses Protokoll basiert auf der Trennung von ZNS-Zellsuspensionen über diskontinuierliche Percoll Gradienten basiert. Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für die Identifizierung von verschiedenen Immunzellen Populationen in einer einzigen Probe mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.
Protokoll
Vorbereitung der Reagenzien
Bereiten Lager isotonischen Percoll (SIP), 4 ml pro Gehirn, indem man 9 Teile Percoll mit einem Teil 10X HBSS ohne Ca + + und Mg + +.
Bereiten Sie SIP bei 70% in 1X HBSS ohne Ca + + und Mg + +, 2 ml pro Kopf in einen 15 ml-Polypropylen-konischen Rohr verzichtet.
Hinweis: Es wird empfohlen, Percoll bei Raumtemperatur verwendet werden sollte, falls verwendet Kälte, neigen Zellen zu verklumpen und Zellseparation ist weniger effizient.
Tissue-Sammlung und Homogenisierung
Anesthetize Mäusen und perfuse dur....
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Diskussion
Analysen von Zelloberflächenmarker in CNS Leukozyten aus normalen und entzündeten Mausgeweben seit mehreren Jahrzehnten 1-3 verwendet worden. Isolation Protokolle sind in der Trennung von Mikroglia und Leukozyten durch Dichtezentrifugation 4. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung von CNS Leukozyten mit diskontinuierlichen Percoll-Gradienten. Nach der Isolierung von Zellen, Färbung mit verschiedenen Antikörpern wie, aber nicht beschränkt auf-CD45 ermöglicht CD4, CD8.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T, um AEC) und der University of Texas at San Antonio unterstützt.
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Materialien
Tissue Homogenisierung und Farbverläufe
- Percoll (Amersham)
- 10x Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium und Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, ohne Phenolrot (Gibco)
- 7-ml-oder 15-ml Dounce Tissue Grinder (VWR)
Durchflusszytometrie
- Zellfärbung Buffer (Biolegend)
- Gereinigtem Ratten Anti-Mouse CD16/CD32 (Maus BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hämazytometer (Fisher)
- Anti-Maus-CD45 (Klon 30-F11), CD4 (Klon RM4-5), CD19 (Klon 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, ohne Calcium und Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyd (Sigma Aldrich)
- Durchflusszytometrie-Analyse mit einer LSR II (BD Biosciences) durchgeführt
Referenzen
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
