Gezielte Virusabgabe an kortikospinale Neuronen bei einer neugeborenen Ratte zur Untersuchung von Rückenmarksverletzungen

Zusammenfassung

Quelle: Smit, R. D., et al. Ausrichtung auf den Corticospinaltrakt bei neugeborenen Ratten mit einem doppelviralen Vektor unter Verwendung kombinierter Hirn- und Wirbelsäulenchirurgie. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die gezielte Verabreichung von viralen Vektoren an kortikospinale Neuronen bei einer neugeborenen Ratte. Das Protokoll ermöglicht eine präzise Genexpression durch anterograde und retrograde Virusinjektionen und erleichtert die Erforschung der neuronalen Regeneration und Plastizität nach Rückenmarksverletzungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Direkte Injektionen in das Rückenmark, die auf die Axonendigungen abzielen

1. Nähern Sie sich mit der Spitze der Glasinjektionsnadel der Mittellinie des Rückenmarks, indem Sie die Spinalarterie identifizieren. Wenn die Spinalarterie jedoch merklich dezentriert ist oder in irgendeiner Weise abweicht, nähern Sie sich der Mittellinie, indem Sie die Position des C2-Dornfortsatzes verwenden und diese über die Länge der Wirbelsäule extrapolieren.
   HINWEIS: Laden Sie das Virus in den Injektor, indem Sie ~5 μl auf ein Stück Parafilm pipettieren und die Nadel so positionieren, dass die Spitze auf dem Viruströpfchen aufliegt.
2. Nach der Identifizierung positionieren Sie die Nadel direkt hinter der C5-Lamina an der ungefähren Mittellinie und verwenden Sie diese als Referenzpunkt. Bewegen Sie dann mit dem Mikromanipulator die Nadel seitlich um 0,3 mm nach rechts. Senken Sie die Nadel ab, bis sie gerade die Oberfläche des Rückenmarks berührt; Aus dieser Tiefe tauchen Sie die Nadel 0,6 mm in das Rückenmark ein. Falls nötig, tauchen Sie die Nadel weiter ein, bis sie das Rückenmark durchsticht. Ziehen Sie dann die Nadel auf die entsprechende Tiefe zurück oder senken Sie sie ab.
3. Injizieren Sie 1 μl retro-adeno-assoziiertes Virus2-scCre bei 250 nL/min. Warten Sie nach Abschluss der Injektion 2 Minuten, bis das Virus in das Rückenmark diffundiert ist, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen. Wiederholen Sie die Injektionen mit denselben lateralen und Tiefenkoordinaten an zwei weiteren Stellen innerhalb des Wirbelsäulenfensters, eine in der Mitte und die letzte direkt vor der T1-Lamina.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Flexible Nadelbefestigung	World Precision Instruments	MF34G-5	Zum Reinigen von Glasnadeln und zum Laden von rotem Öl in Glasnadeln.
Glaskapillarrohre	World Precision Instruments	4878	Für gezogene Glasnadeln - sollten für Nanoliter-Injektoren ausgelegt sein.
Mikromanipulator mit einer Nonius-Skala	Kanetec	N/A	Für präzises Zielen während der Operation.
Laborstandard Stereotaktisches Instrument	Stoelting	51600	Um den Halter für das Neugeborenen-Stereotaxische an Ort und Stelle
Lab Standard mit Maus- und Neugeborenen-Adapter		51615	Für die Fixierung des Schädels von Neugeborenen während der Schädelchirurgie und Wirbelsäuleninjektionen
Mikroskop mit Licht und Nonius-Skala Okular	Leitz Wetzlar	N/A	Wird verwendet, um das Anfasen von gezogenen Glaskapillarrohren zu funktionalen Glasnadeln zu visualisieren und zu messen.
Steuerung der MikroSpritzenpumpe	World Precision Instruments	62403	Zur Steuerung der Injektionsrate.
Nanoliter 2000 Pumpenkopf-Injektor	World Precision Instruments	500150	Zum kontrollierten Laden und Injizieren von Viren.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre Plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (Plasmid #44361)	Bryan Roths Labor über Addgene		DREADD plasmid
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Zur Verwendung mit den 1 ml und 10 ml Spritzen, um die Injektion des Tiermodells zu ermöglichen.
Rattenzahnzange	Roboz	RS-5152	Zum Greifen von Dornfortsätzen.
Sterile Kochsalzlösung	Baxter Healthcare Corporation	281324	Zur Verwendung bei der Blutreinigung und zum Ersatz von Flüssigkeiten nach der Operation.
OP-Handschuhe	N/A	N/A	Zur Verwendung durch den Chirurgen, um ein steriles Feld während der Operation zu erhalten.
Chirurgisches Heizkissen	N/A	N/A	Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tiermodells während der Operation.
Operationsmikroskop	N/A	N/A	Zur besseren Visualisierung der Operationswunde.

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