Implantation einer flexiblen biokompatiblen Sonde in ein Glioblastom-Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Lefevre, M. C., et al., Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Implantation einer flexiblen, biokompatiblen Sonde in ein Glioblastom-Mausmodell, um eine gezielte gepulste elektrische Feldtherapie für neurotherapeutische Anwendungen zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Das In-vivo-Modell
   HINWEIS: Erwachsene mehrfarbige fluoreszierende AMU-Neuroinflam-Mäuse (B6. Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) verwendet; Diese Mäuse weisen die Markierung einer Subpopulation von Thy1⁺-Neuronen durch transgene Expression von ECFP, die Markierung von peripheren LyzM⁺-Entzündungszellen durch transgene Expression von EGFP und die Markierung eines Subtyps von Mikroglia, die EYFP exprimieren, unter der Kontrolle von Cd11c⁺ auf. Kurz gesagt, die Tiere werden vor jeder Behandlung oder Injektion 2 Minuten lang leicht mit 1,5 % Isofluran sediert. Vor der Operation werden die Tiere mit Ketamin (120 mg/kg; IP) und Xylazin (12 mg/kg; IP). Dann wird 3% Lidocain-Gel lokal aufgetragen, um Schmerzen in den Ohren zu lindern, die mit der Fixierung der stereotaktischen Unterstützung verbunden sind. Dann wird 0,25% ige Bupivacain-Lösung an die Operationsstelle verabreicht, um die durch die Kraniotomie verursachten Schmerzen zu lindern. Nachdem die Maus für die Operation vorbereitet war, wurde eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 4 mm durchgeführt. Mit einer 26 G Nadel wurde in der Mitte der Kraniotomie ein Loch in die Dura-mater gebohrt und dem Tumorsphäroid das Injektionssystem injiziert. Zusätzlich wurde, wie hier beschrieben, eine flexible Elektrode auf dem GCamp6 oder DsRed platziert, die das Tumorsphäroid exprimierte, bevor die Kraniotomie mit einem Glasfenster verschlossen wurde.
   1. Geben Sie einen Tropfen Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) so, dass sie die Kraniotomie bedeckt. Platzieren Sie die flexible Elektrode auf dem DPBS-Tropfen und legen Sie die Rückseite der Sonde mit den Kontaktpads vorsichtig auf die Rückseite der Maus (Abbildung 1B) (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Verwenden Sie sterile Handschuhe und eine "Nur Spitze"-Technik. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche in Berührung kommt. Bieten Sie während dieses Vorgangs thermische Unterstützung.
   2. Berühren Sie den DPBS-Tropfen mit einem kleinen Stück Papier, um DPBS zu absorbieren, bis die Sonde flach auf der Dura aufliegt und der Krümmung des Gehirns folgt. Stellen Sie sicher, dass eine kleine Schicht DPBS unter den Elektroden verbleibt, ohne von der Seite der Elektrode zu entweichen. Dies gewährleistet eine Barriere gegen das Überschwappen von Klebstoff bei den nächsten Schritten.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch.
   3. Geben Sie einen kleinen Tropfen Silikonkleber auf die Sonde und decken Sie sie mit einem runden 5 mm Deckglas ab. Schieben Sie das Deckglas nach unten, bis das Silikon gleichmäßig verteilt ist und der Abstand zwischen dem Deckglas und der Sonde minimal ist. Drücke das Deckglas für weitere 30 Sekunden nach unten, damit sich das Silikon verfestigen kann.
   4. Um das Deckglas zu sichern, tragen Sie schnell Sekundenkleber auf die Seiten auf und drücken Sie ihn nach unten, bis der Kleber fest ausgehärtet ist.
   5. Tragen Sie mit einem Zahnstocher Sekundenkleber auf den Hals der Sonde auf und achten Sie darauf, dass der Sekundenkleber unter den Hals gezogen wird, um ihm einen stabilen Halt zu bieten.
   6. Bedecken Sie den Schädel mit Zahnzement, um eine chronische Kappe zu bilden. Achten Sie besonders darauf, nur die Ränder des Deckglases abzudecken.
   7. Heben Sie die Rückseite der Sonde an und tragen Sie Zement unter den Hals auf. Legen Sie die Sonde auf den Zement, bevor er aushärtet. Schieben Sie den Hals der Sonde vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette nach unten, so dass sich ihre Oberfläche auf der gleichen Höhe wie die des Deckglases befindet und dem Mikroskopobjektiv während des Experiments nicht im Weg ist.
   8. Decken Sie die Oberseite des Sondenhalses mit nicht mehr als 1,5 mm Zahnzementschicht ab, um einen festen Halt auf der Sonde zu erreichen. Bauen Sie einen Zementbrunnen mit einem 1,5 mm breiten Grat in einem Abstand von 1-2 mm um das Deckglas, um ein Becken für die Immersionsflüssigkeit für die Zwei-Photonen-Bildgebung zu schaffen (Abbildung 1C).
   9. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, tragen Sie postoperative Analgetika Buprenorphin (0,05 mg/kg, 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht subkutan) auf und halten Sie das Tier in einer warmen Atmosphäre, bis es aufwacht. Dazu gehört die Nähe zu einer Infrarot-Glühbirne sowie das Einwickeln des Tieres in ein Papiertuch.
      HINWEIS: Platzieren Sie ein Thermometer auf Höhe der Maus, um die Temperatur zu überwachen.
   10. Charakterisierung der Impedanz im Bereich von 1-10 kHz mit einem Potentiostaten.
   11. Lassen Sie das Tier mindestens 10 Tage lang von der Operation genesen. Verabreichen Sie unmittelbar nach der Operation entzündungshemmende Medikamente und überwachen Sie weiterhin den Zustand des Tieres, um eine angemessene postoperative Analgesie bereitzustellen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die In-vivo-Anwendung. (A) Schema für In-vivo-Versuche. (B) Platzierung der Sonde vor dem Auftragen von Deckglas und Acrylharz. (C) Abgeschlossene Sondenimplantation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acrylharz	Fischer wissenschaftlicher	NC1455685
Buprenorphin	Axience
Lab hergestellt Pulsgenerator
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Rundes Deckglas 5 mm Durchmesser	Fischer scientific	50-949-439
Silikonkleber Kwik-Sil	World Precision Instruments
Sekundenkleber	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14	Humane Glioblastomzellen