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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
- Vorbereiten der Mikroinjektionsspritze und des Mikroinjektors für die Injektion:
- Verriegeln Sie jede gasdichte Mikroinjektionsspritze im Gestell der Mikroinjektionspumpe.
- Legen Sie die Spitze der gasdichten Spritze in das sterile Wasser, das sich in einer kleinen Waage befindet, und flattern Sie vorsichtig mit dem Kolben, um den internen Draht zu schmieren. Ziehen Sie den Kolben gleichmäßig zum Anschlag an der Pumpe, um ihn mit Wasser zu füllen.
- Schieben Sie den PE20-Schlauch, der mit dem Mikroinjektor verbunden ist, auf eine 26-G-Nadel (braune Nabe), die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die mit sterilem Wasser gefüllt ist. Sprühen Sie steriles Wasser durch den Mikroinjektor und überprüfen Sie das Sprühmuster und den Abstand.
HINWEIS: Das Wasser sollte sehr weit und direkt aus der Mikroinjektorspitze spritzen. Wenn der Strahl nicht gerade ist, ist die Einspritzstelle nicht korrekt. - Stellen Sie den sterilisierten Mikroinjektor auf ein steriles Feld.
- Schieben Sie den Schlauch von der Nadel ab und halten Sie den Mikroinjektorschlauch aufrecht, um ein Abtropfen von Wasser zu verhindern, und schneiden Sie den Schlauch auch unterhalb des durch die Nadel beschädigten Bereichs ab.
- Schieben Sie den Kolben der Mikroinjektionsspritze leicht nach vorne, um ein Tröpfchen am Ende der Nadel zu erzeugen, und schieben Sie den wassergefüllten PE20-Schlauch (der mit dem Mikroinjektor verbunden ist) auf die Nadel.
HINWEIS: Dadurch entsteht eine Flüssigkeit-zu-Flüssig-Verbindung, die einen angemessenen Gegendruck ermöglicht, der eine Verstopfung lösen könnte, die sich an der Spitze des Mikroinjektors bilden könnte. - Schieben Sie den Kolben vollständig nach vorne, um die Probenbeladung vorzubereiten und sicherzustellen, dass keine Spuren von Ethanol im Mikroinjektor verbleiben.
- Überprüfen Sie die Einrichtung auf Undichtigkeiten, indem Sie den Wassertropfen, der sich an der Spitze des Mikroinjektors gebildet hat, mehrmals mit einem sauberen Labortuch berühren.
- HINWEIS: Wenn Sie das Labortuch berühren, sollte sich nur ein nasser Fleck bilden. Wenn es mehr Tropfen gibt, gibt es ein Leck im System.
- Vermeiden Sie Lecks, indem Sie das Auftragen von Sekundenkleber kontrollieren und den PE20-Schlauch mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge kürzen, wenn der PE20-Schlauch von einer Verbindung entfernt wird.
- Ziehen Sie den Spritzenkolben um 0,2 μl zurück, wodurch eine Blase zwischen dem sterilen Wasser im PE20-Schlauch/Mikroinjektor und der zu injizierenden Lösung entsteht.
- HINWEIS: Diese Blase verhindert die Verdünnung des Injektats, die Kontamination des Wassers und ermöglicht die Überwachung des Injektionsprozesses, da es sich während der Injektion bewegt. Es sollte eine einzelne, feste Blase erzeugt werden.
- Setzen Sie den Mikroinjektor in das zu injizierende Reagenz ein und ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zum Anschlag.
- Vorbereitung eines Tieres für die Injektion:
- Halten Sie die Brust der Ratte gegen die Brust des Experimentators. Reinigen Sie den Bereich um die Kanülen mit einem Baumwollapplikator, der mit 70 % Ethanol (v/v) getränkt ist.
- HINWEIS: Bei richtiger Handhabung können Mäuse in einer hohlen Hand sanft zurückgehalten werden. Andernfalls kann ein Scrubfing erforderlich sein.
- Entfernen Sie die Obturatoren mit einer kleinen Pinzette und legen Sie sie mit 70% Ethanol (v/v) in das Waagscherchen.
- Injektionen durchführen:
- Setzen Sie den gefüllten Mikroinjektor in die Kanüle ein. Drücken Sie auf Start an der Mikroinjektionspumpe und überwachen Sie die Bewegung der Blase.
- HINWEIS: Es kann erforderlich sein, leichten Druck auszuüben, um sicherzustellen, dass sich die Mikroinjektoren nicht abheben. Die Blase sollte gleichmäßig vorrücken und vollständig in den Mikroinjektor eindringen.
- Entfernen Sie die Mikroinjektoren aus der Kanüle und ersetzen Sie die Obturatoren, sobald die Injektion abgeschlossen ist und die Diffusionsphase nach der Injektion abgelaufen ist.
- HINWEIS: Typische Diffusionszeiten nach der Injektion betragen 2 – 4 Minuten für pharmakologische Reagenzien und 2 – 10 Minuten für Viren. Wenn der Mikroinjektor während der Zeit nach der Infusion drin bleibt, wird verhindert, dass das Injektor in die Kanülen zurückfließt, anstatt in das Gewebe zu diffundieren. Platzieren Sie Obturatoren an der Seite des mit Ethanol gefüllten Waagschiffchens, damit das Ethanol abfließen kann, bevor es wieder in die Kanüle eingeführt wird.