Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Proliferation und Differenzierung von lt-NES-Zellen
HINWEIS: Humane induzierte pluripotente Stammzellen, die aus langfristig selbsterneuernden neuroepithelialen Stammzellen (lt-NES) gewonnen werden, werden erzeugt und mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter einem konstitutiven Promotor (GFP-lt-NES-Zellen) trägt. Fläschchen mit 3 x 106 Zellen werden bis zur Verwendung bei -150 °C gelagert.
1. Vorbereitung der Stammlösungen und Medien
1. Verdünnen Sie 100 μg basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) auf eine Stammkonzentration von 10 μg/ml. Bereiten Sie 100 μl Aliquots vor.
2. Verdünnen Sie 100 μg epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in 10 mL PBS-0,1% BSA, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie 100 μl Aliquots vor.
3. Aliquot 50x B27 Supplement in einem Volumen von 100 μL pro Aliquot.
4. Verdünnen Sie 10 mg Poly-L-Ornithin in 100 mL deionisiertem Wasser, um eine Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erreichen. Stellen Sie 1 ml Aliquote her.
5. Bereiten Sie 30 μL Aliquots von 1,20 mg/ml Mauslaminin vor.
6. Verdünnen Sie 10 mL Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,25%) in 90 mL PBS auf eine Stammkonzentration von 0,025%. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
7. Verdünnen Sie 0,025 g Trypsin-Inhibitor in 50 mL PBS auf eine Stammkonzentration von 0,5 mg/ml. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
8. Verdünnen Sie 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV Integration Site Family Member 3A) in 1 mL PBS-0,1% BSA, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie BMP4 (knochenmorphogenetisches Protein 4) auf die gleiche Weise vor. Aliquot in ein Volumen von 100 μL.
9. Verdünnen Sie 1 mg Cyclopamin in 2,5 mL Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 400 μg/mL und stellen Sie 100 μL Aliquote her.
10. Basismedium (Tabelle 1) und differenzierungsdefiniertes Medium (DDM, Tabelle 2) vorbereiten und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
2. Beschichtung von Kulturschalen
1. Um die Schalen für die Kultivierung der GFP-It-NES-Zellen während der Proliferation oder Differenzierung vorzubeschichten, verdünnen Sie Poly-L-Ornithin 1:100 in deionisiertem Wasser und geben Sie 5 ml der Lösung in einen T25-Kolben. Über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
2. Waschen Sie die mit Poly-L-Ornithin beschichteten Platten 1x mit deionisiertem Wasser und 1x mit PBS.
3. Für GFP-It-NES-Zellen in der Proliferation, verdünnen Sie Mauslaminin bei 1:500 in PBS und inkubieren Sie mindestens 2 Stunden bei 37 °C. Für GFP-It-NES-Zellen in der Differenzierung wird Mauslaminin bei 1:100 in PBS verdünnt und mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert.
3. Proliferation der GFP-lt-NES-Zellen
1. Erwärmen Sie 5 mL (zum Waschen) und 5 mL (zum Aussaaten) Basismedium in zwei verschiedenen 15 mL Röhrchen.
2. Tauen Sie ein Fläschchen mit GFP-lt-NES-Zellen schnell bei 37 °C auf, geben Sie sie in das Waschröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 Minuten.
3. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig, ohne das Pellet zu berühren, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL vorgewärmtem basischem Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Aussaatröhrchen mit basischem Medium, das mit den Proliferationsfaktoren EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) und B27 (10 ng/ml) ergänzt wird. Die Zellen werden auf einen mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten T25-Kolben gesät.
4. Füttern Sie die Zellen jeden Tag mit Proliferationsfaktoren. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird. Passieren Sie die Zellen jeden dritten oder vierten Tag (1 Tag nach Erreichen einer 100%igen Konfluenz).
4. Teilung der GFP-lt-NES-Zellen für Proliferation und Differenzierung
1. 5 ml basisches Medium pro Kolben (zur Entnahme der Zellen) plus das Gesamtvolumen, das für die erneute Aussaat benötigt wird, vorwärmen.
HINWEIS: Die Passage erfolgt bei einer Verdünnung von 1:3, um die Zellen in der Proliferation zu halten, was 15 ml basisches Medium erfordert, und einer 1:6-Verdünnung, um die Differenzierung zu starten, wobei 30 ml basisches Medium erforderlich sind.
2. Nehmen Sie das Medium durch Aspiration aus dem Zellkulturkolben und fügen Sie 500 μl vorgewärmtes 0,025% Trypsin hinzu. 5-10 min bei RT inkubieren. Die Ablösung der Zellen kann unter einem Standardlichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung bestätigt werden.
3. Fügen Sie ein gleiches Volumen des Trypsin-Inhibitors (0,5 mg/ml Endkonzentration) hinzu, gefolgt von 5 mL warmem basischem Medium. Lösen und sammeln Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Die Zellen in ein 15 mL Röhrchen umfüllen und 5 min bei 300 x g zentrifugieren.
4. Um die Zellen in der Proliferation zu halten, in einer Verdünnung von 1:3 in frischem basischem Medium, das mit Proliferationsfaktoren ergänzt ist, neu plattieren und Schritt 1.3.4 wiederholen.
5. Kortikale Differenzierung der GFP-lt-NES-Zellen
1. Am Tag 0 werden die Zellen (für die Differenzierung) in 30 ml basischem Medium, das mit Proliferationsfaktoren ergänzt ist, resuspendiert und in sechs differenzierungsbeschichteten T25-Kolben (1:6 geteilt) pattiert.
2. Am Tag 1 ändere die Hälfte des Mediums auf DDM und füge Proliferationsfaktoren bei der Hälfte ihrer Konzentration hinzu.
3. An Tag 2 ändere das Medium komplett auf DDM, ergänzt durch Differenzierungsfaktoren: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) und Cyclopamin (400 ng/ml).
4. Fügen Sie an Tag 4 nur die Differenzierungsfaktoren hinzu. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird.
5. An Tag 6 ändere das Medium auf DDM, ergänzt mit BMP4 und Wnt3a. Das Cyclopamin wird in diesem Schritt entfernt.
6. Am Tag 7 lösen Sie die Zellen wie in Schritt 1.4.2 und Schritt 1.4.3 beschrieben.
2. Transplantation der GFP-lt-NES-Zellen in organotypische hACtx-Schnitte
HINWEIS: Das adulte humane kortikale Gewebe (hACtx) sollte vor der Zelltransplantation 1 Woche lang kultiviert werden. Um das Transplantationsverfahren zu erleichtern, ist es notwendig, 2 ml des hACtx-Mediums von der Oberseite des Einsatzes zu entfernen, um ein Schweben des Gewebes zu verhindern.
1. Resuspendieren Sie die kortikal geprimten GFP-lt-NES-Zellen (aus Schritt 1.5.6) in einer kalten, reinen Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/μl und überführen Sie die Lösung in ein kleineres steriles Röhrchen.
HINWEIS: Während des Transplantationsverfahrens sollten alle Materialien (Pipettenspitzen, Röhrchen, Kapillaren usw.) vorgekühlt werden, um eine Verfestigung des Gels zu vermeiden. Tauen Sie das Basalmembran-Matrix-Gel vor der Verwendung 30 Minuten lang auf Eis auf.
2. Sammeln Sie die Zellsuspension in einer kalten Glaskapillare, die zum Absaugen mit einem Gummisauger verbunden ist. Injizieren Sie die Zellsuspension in kleinen Tropfen (je ca. 1 μL), indem Sie die halbtrockene Gewebescheibe an verschiedenen Stellen einstechen.
3. 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, damit sich das Gel verfestigt. Übertragen Sie die Platte aus dem Inkubator zurück in die Haube und geben Sie vorsichtig 2 ml hACtx-Medium auf die Oberseite des Einsatzes, um das Gewebe vollständig einzutauchen.
4. Ersetzen Sie den Nährboden einmal pro Woche durch frisches hACtx-Medium.