Stereotaktische Injektion von Viren für eine stabile genetische Veränderung in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Porlan, E., et al. Stabile und effiziente genetische Modifikation von Zellen in der adulten Maus V-SVZ zur Analyse von autonomen und nicht-autonomen Effekten neuraler Stammzellen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine stabile genetische Modifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) in der ventrikulär-subventrikulären Zone (V-SVZ) durch stereotaktische Injektion eines virustragenden therapeutischen Gens in ein Mausmodell. Das Virus dringt in NSCs ein, durchläuft eine reverse Transkription, integriert sich in das Genom und ermöglicht eine stabile und effiziente genetische Modifikation für neurotherapeutische Anwendungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Stereotaktische Injektion des lateralen Ventrikels (LV) in die ventrikulär-subventrikuläre Zone (V-SVZ)/Striatum-Grenze oder in die

1. LV-Mikroinjektion von LV
   1. Auswahl und Sterilisation von Werkzeugen, die für die Operation benötigt werden (Skalpell, Bohrer und kleine Pinzette).
   2. Betäuben Sie eine 6-8 Wochen alte Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion einer tierärztlich überwachten Mischung aus Ketamin und Medetomidin. Wiegen Sie jedes Tier und dosieren Sie es mit jeweils 50-75 mg Ketamin und 0,5-1 mg Medetomidin pro kg Körpergewicht der Maus (ca. 100-125 μl der Ketamin/Medetomidin-Arbeitslösung pro Maus).
   3. Beurteilen Sie die Narkoseebene, indem Sie die Zehen, den Schwanz oder das Ohr einklemmen und sicherstellen, dass das Tier keine Reaktion zeigt.
   4. Sobald die Maus anästhesiert ist, injizieren Sie Butorphanol subkutan in einer Enddosis von 0,4-0,5 mg pro kg Mausgewicht, um postoperative Schmerzen zu minimieren.
   5. Rasieren Sie den Bereich zwischen den Ohren und desinfizieren Sie die Haut mit einem Jodophor wie Jodopovidon oder 70%igem Ethanol. Reinigen Sie mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Achten Sie darauf, das Tier nicht zu stark zu nass zu machen, da dies die Unterkühlung verschlimmern kann.
   6. Setzen Sie das Tier in Bauchlage auf einen stereotaktischen Rahmen und fixieren Sie den Kopf vorsichtig mit den Ohrstangen und der Gaumenstütze des Geräts. Lassen Sie die Maus mit einem Heizkissen auf 37 °C eingestellt und tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen auf.
   7. Machen Sie mit einem Skalpell einen 1 cm langen Schnitt in Längsrichtung in die Kopfhaut und ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um den Schädel mit einer feinen Pinzette freizulegen.
   8. Reinigen Sie die Knochenoberfläche vorsichtig mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze. Reinigen Sie den freiliegenden Schädelknochen von jeglichem verbleibenden Gewebe.
   9. Montieren Sie die sterilisierte Spritze mit dem Spritzenhalter auf das stereotaktische Gerät.
   10. Bewegen Sie den Spritzenhalter entlang der x-, y- und z-Achse, bis die Spitze der Spritzennadel auf dem Bregma positioniert ist, dem Verbindungspunkt, an dem die sagittale Naht (longitudinal und medial) senkrecht von der koronalen Naht geschnitten wird (Abbildung 1b). Stellen Sie sicher, dass die "Null"-Position der dorso-ventralen (DV) Achse an der Schädeloberfläche beim Bregma liegt.
   11. Bewegen Sie die Spritze auf die Zielkoordinaten x und y (siehe Tabelle 1 und Abbildung 1b).
   12. Beschriften Sie die X-, Y- und Z-Zielkoordinaten auf der Nonius-Skala, um später zur Injektionsstelle zurückkehren zu können. Markieren Sie den Knochen an den x- und y-Koordinaten mit einem chirurgischen Markierungsstift.
   13. Bewegen Sie die Spritze vom Arbeitsbereich weg.
   14. Bohren Sie mit einer elektrischen Bohrmaschine vorsichtig ein Loch in den Schädel, um das Gehirn nicht zu beschädigen. Bohren Sie nicht in die Pialoberfläche, da dies die Gehirnoberfläche beschädigen kann.
   15. Befüllen Sie die Spritze mit 10 μl der Viruslösung mit 10⁶ TU/μl (Transduziereinheiten pro Mikroliter). Verwenden Sie eine scharfe, abgeschrägte 33-Gauge-Nadel, deren Spitze einen Winkel von 10-12° hat. Positionieren Sie die Spritzennadel in einem 90°-Winkel zur Gehirnoberfläche.
   16. Bewegen Sie die Spritze zurück an die Injektionsstelle und bewegen Sie sie nach unten, bis die Spitze die Pialoberfläche berührt.
   17. Dringen Sie mit der Spritze in das Gehirn bis zur z-Koordinate in der DV-Achse ein.
   18. Geben Sie die Virussuspension langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,2 μl/min frei, um die Schädigung des Hirngewebes durch übermäßigen Flüssigkeitsdruck zu minimieren.
   19. Warten Sie 5-10 Minuten, um den Rückfluss der Virussuspension zu minimieren, und ziehen Sie die Spritze dann sehr langsam zurück.

Koordinaten

Region der Injektion<
	Antero-posterior (AP)	Medio-lateral (ML)	Dorso-ventral (DV)
SEZ/Striatumrand	+0,6 mm	+1,2	mm-3,0 mm
Lateraler Ventrikel-0,3 mm	+1,0	mm-2,6 mm

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Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die Injektionen. Für die antero-posteriore (AP) und medio-laterale (ML) Achse werden die x- und y-Koordinaten als Abstand (in mm) vom Bregma angegeben. "-" steht für "nach hinten". Bei den DV-Koordinaten ist "Null" die Oberfläche des Schädels am Bregma-Punkt, und die DV-Koordinaten geben den Abstand (in mm) von diesem Punkt nach unten an.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Teile des Verfahrens. a) Erzeugung von LV für In-vivo-Markierungsstudien, von der Transfektion menschlicher embryonaler Nierenzellen 293T (HEK293T) mit geeigneten Plasmiden zur Erzeugung der LV bis z...

Materialien