Manipulation von Neuralplattenzellen durch In-utero-Nanoinjektion in einem embryonalen Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Mangold, K., H el. al., Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die In-utero-Nanoinjektionsmethode für das Targeting von neuralen Platten in einem embryonalen Mausmodell. Eine lentivirale Lösung mit hohem Titer wird in die Fruchthöhle injiziert, wo sie sich in die Zellen der Neuralplatte integriert und so eine stabile Genmanipulation für die neurologische Entwicklungsforschung und therapeutische Anwendungen ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Injektionen

HINWEIS: Alle Instrumente, die bei diesem Verfahren verwendet werden, werden vor der Operation und zwischen jeder Maus sterilisiert.

1. Betäuben Sie die erste Hündin mit ideal großen Karies.
2. Lege das Weibchen auf den Tisch und fixiere es.
3. Tragen Sie Augengel auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, und injizieren Sie Schmerzmittel subkutan.
   HINWEIS: Empfohlene Analgetika: Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg Körpergewicht) oder Flunixin (2,5 mg/kg) oder ähnliches in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzbestimmungen. Die multimodale perioperative Analgesie wird mit injizierten Analgetika und Isofluran aufrechterhalten.
4. Bereiten Sie den Unterbauch aseptisch vor, indem Sie ihn mit einem mit 0,5 mg/ml Chlorhexidinlösung (oder ähnlichem) getränkten Tuch abwischen und die Haut trocknen. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen 1,5 bis 2,0 cm langen vertikalen Hautschnitt in der Mittellinie im Unterbauch vorzunehmen.
   HINWEIS: Bereiten Sie den Operationsbereich gemäß den vor Ort zugelassenen Desinfektionsroutinen vor.
5. Heben Sie die Haut sanft an und befreien Sie die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht, etwa 1 cm um den Schnittpunkt herum, um das Nähen nach der Operation zu erleichtern.
6. Machen Sie einen 1 cm vertikalen Schnitt in der Mittellinie in die Muskelschicht.
7. Heben Sie mit einer Pinzette eine Seite der Haut- und Muskelschicht an und suchen Sie mit dem anderen Paar nach den Gebärmutterhörnern.
   HINWEIS: Die Deziduen sind wie Perlen an einer Kette angeordnet, während der Darm aus einer langen, durchgehenden Röhre besteht (Abbildung 1A).
8. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig beide Gebärmutterhörner aus dem Bauch. Halten Sie das Gewebe zwischen den Embryonen; Drücken Sie sie nicht direkt zusammen (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Die Gebärmutter ist am Gebärmutterhals mit dem Körper verbunden, und die beiden Eierstöcke/Eileiter sind über Bänder verbunden. Ziehen/lösen Sie die Gebärmutter nicht von diesen Ankerpunkten.
9. Zählen Sie und notieren Sie sich die Anzahl der Embryonen auf der linken und rechten Seite.
10. Nummerieren Sie die Embryonen entweder vom Eierstock bis zum Gebärmutterhals oder vom Gebärmutterhals bis zum Eierstock.
    HINWEIS: Dies ist besonders wichtig, wenn injizierte Embryonen im Embryonalstadium entnommen werden.
11. Schieben Sie mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig alle Embryonen zurück in die Bauchhöhle, mit Ausnahme der ersten drei, die injiziert werden sollen.
12. Geben Sie einen Tropfen PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) auf das Gummiband in der Petrischale und halten Sie es direkt über die Embryonen.
13. Führen Sie eine geschlossene Pinzette in den Schnitt des Gummibandes ein und lassen Sie die Pinzette los, um den elastischen Schnitt zu öffnen, so dass die Flüssigkeit auf die Embryonen tropft.
    HINWEIS: Dies stellt sicher, dass die Embryonen rehydriert werden und dass die elastische Membran an der nassen Haut des Weibchens haftet, wodurch ein Austreten von PBS in den nächsten Schritten verhindert wird.
14. Ziehen Sie einen Abschnitt der Gebärmutter, der drei Embryonen entspricht, mit einer Pinzette durch das Gummiband und setzen Sie die Petrischale vorsichtig auf den Bauch der Frau.
15. Passen Sie mit der Pinzette und einem feuchten Wattestäbchen die Position der Gebärmutter und das Gummiband an, um sicherzustellen, dass das Gummiband an der Haut des Weibchens befestigt ist, um ein Austreten von PBS zu verhindern.
16. Verwenden Sie die vier Tonfüße, um die Petrischale direkt über dem Bauch zu sichern und zu befestigen, um den Druck auf das Weibchen und die Empfindlichkeit der Bildgebung auf die Atmung und den Herzschlag des Weibchens zu reduzieren.
17. Drücken Sie den Modellierzylinder rechts von den Embryonen/der Gebärmutter nach unten, um die Gebärmutter zu fixieren (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Diese Orientierungsanweisung geht davon aus, dass sich die Nadel links von der Frau befindet und dass die Embryonen des linken Gebärmutterhorns der Frau freiliegen. Die Seite der Gebärmutter (linkes oder rechtes Uterushorn) ist entscheidend, da das Amnionom (AC) entweder der Nadel zugewandt ist (linkes Horn; Abbildung 1D) oder dem stabilisierenden Tonzylinder zugewandt (rechtes Horn; Abbildung 1E).
18. Um Embryonen aus dem rechten Gebärmutterhorn zu injizieren, platzieren Sie den Tonzylinder auf der linken Seite der Embryonen (Abbildung 1F) und drehen Sie den Heiztisch um 180° (Abbildung 1G), um die richtige Ausrichtung zu erreichen. Wenn die Nadel stattdessen bewegt werden kann, passen Sie sie entsprechend dem jeweiligen Setup an.
19. Geben Sie PBS in die Petrischale, bis die Embryonen und die Gebärmutter mit PBS bedeckt sind.
20. Senken Sie die Ultraschallsonde in das PBS ab und stellen Sie die Maus-/Operationsliege so ein, dass der erste Embryo mit der Ultraschallsonde ausgerichtet ist, um die Aufzeichnung der Injektionen zu erleichtern.
    HINWEIS: "Erster" bezieht sich auf die Nummerierung der Embryonen vom Eierstock bis zum Gebärmutterhals.
21. Scannen Sie alle drei Embryonen und untersuchen Sie die ACs. Bestimmen Sie das Injektionsvolumen wie folgt:
    1. Messen Sie den Durchmesser des Wechselstroms mit dem Ultraschallgerät. Injizieren Sie 69 nL, wenn der AC-Durchmesser ≤0,2 mm beträgt; 2 x 69 nL (= 138 nL) einspritzen, wenn der AC-Durchmesser >0,2 mm und ≤0,29 mm beträgt; und injizieren Sie 3 x 69 nL (= 207 nL), wenn der AC-Durchmesser 0,29 mm > (Abbildung 1H).
       >HINWEIS: Frühere Experimente haben gezeigt, dass bis zu 207 nL Injektionsvolumen bei E7,5 gut vertragen werden. Erfolgreiche Injektionen mit minimalen Auswirkungen auf das Überleben werden erreicht, wenn die relative Volumenzunahme des AC 90 % nicht überschreitet. Schwankungen in der AC-Größe zwischen Wurfgeschwistern oder Mausstämmen sind häufig und erfordern möglicherweise weitere Optimierungen.
22. Stellen Sie die Einspritzmengen mit dem Einspritzregler ein.
23. Stellen Sie die Einspritzgeschwindigkeit auf langsam mit einer Einspritzrate von 23 nL/s ein.
    HINWEIS: Unterschiedliche Gerätemodelle können zu unterschiedlichen Einspritzkräften führen.
24. Senken Sie die Nadel mit den Haupträdern am Schienensystem (x- und z-Ebenen, Abbildung 1I) in das PBS ab und drücken Sie die Leertaste am Nanoinjektor-Controller, bis die Flüssigkeit die Nadelspitze erreicht.
    HINWEIS: Wenn die Nadel verstopft ist, kann die Verstopfung durch Drücken der Leertaste aufgelöst und/oder ausgestoßen werden.
25. Heben Sie die Nadel aus dem PBS und drücken Sie Inject. Stellen Sie sicher, dass ein Tropfen des ungefähr gewünschten Volumens entladen wird.
26. Senken Sie die Nadel in das PBS ab und richten Sie sie mit der Ultraschallsonde und dem Embryo aus, indem Sie den Nanoinjektor mit dem Y-Ebenenrad am Mikromanipulator bewegen (Abbildung 1J).
    HINWEIS: Die Nadelspitze ist perfekt ausgerichtet, wenn sie als heller Fleck auf dem Ultraschallbild erscheint (Abbildung 1K,L). Die Nadel kann mit dem Mikromanipulator in alle drei Richtungsebenen bewegt werden.
27. Stellen Sie den Nadelwinkel mit dem Injektionswinkelrad ein, um einen nahezu senkrechten Injektionswinkel relativ zur Gebärmutterwand zu gewährleisten. Führen Sie die Nadel in einer Bewegung mit dem Einspritzrad am Mikromanipulator in die Klimaanlage ein (Abbildung 1J-M). Behalten Sie die Helligkeit der Nadelspitze im Auge. Wenn die Nadelspitze aus dem Ultraschallbild verschwindet, bewegen Sie die Ultraschallsonde nach vorne oder hinten, um die Nadel wieder in den Fokus zu bringen.
    HINWEIS: Sobald sich die Nadel im AC befindet, können geringfügige Änderungen an der Nadelposition und dem Fokus vorgenommen werden, ohne den Embryo zu beschädigen (Anpassungen innerhalb von ~0,3 mm). Stellen Sie die Nadelposition nicht weiter ein.
28. Drücken Sie Inject (für 207 nL stellen Sie die Lautstärke auf 69 nL ein und injizieren Sie dreimal). Warten Sie nach der Injektion weitere 5-10 s, bevor Sie die Nadel mit einer sanften Bewegung zurückziehen.
29. Verschieben Sie das Stadium zum nächsten Embryo und wiederholen Sie die Schritte 1.22-1.26 für die beiden anderen Embryonen, wenn sie geeignete AC-Größen haben.
30. Heben Sie die Ultraschallsonde und die Nadel mit dem Mikromanipulator aus dem PBS. Drehen Sie die Nadel vom Bediener weg, um Beschädigungen und Verletzungen zu vermeiden.
31. Leiten Sie den 1. und 2. Embryo mit einer Pinzette zurück in den Bauch der Hündin, indem Sie sie vorsichtig durch das Gummiband schieben. Fassen Sie vorsichtig das Gewebe neben dem 3. Embryo und ziehen Sie die Gebärmutter in Richtung des oberen Endes des elastischen Schnitts. Ziehen Sie den 4. bis 6. Embryo vorsichtig mit einer Pinzette nach oben und lassen Sie den 3. Embryo wieder in den Bauch eindringen.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, ohne das PBS zu wechseln oder die Petrischale zu entfernen.
32. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Embryonen mit optimalen ACs injiziert wurden oder das Zeitlimit erreicht ist.
33. Schieben Sie die Embryonen/Gebärmutter vorsichtig zurück in den Bauch der Hündin.
34. Aspirieren Sie das PBS und entfernen Sie die Petrischale. Wenn ein Virus verwendet wurde, behandeln Sie es als infektiösen Abfall.
35. Nähen Sie die Muskelschicht mit Vicryl (USP 6-0, Nadellänge 13 mm, 3/8 Kreis) in einfachen durchgehenden oder unterbrochenen Nähten zusammen und schließen Sie die Haut mit 1-2 Clips (siehe Materialtabelle).
36. Schalten Sie die Isofluranpumpe aus.
37. Entfernen Sie das chirurgische Klebeband und legen Sie das Weibchen in Bauchlage (Bauch nach unten) in einen sauberen Käfig auf einer 40 °C heißen Heizplatte.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass das Weibchen innerhalb von 10 Minuten wieder zu Bewusstsein kommt und mobil ist. Stellen Sie sicher, dass der Vorgang innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen ist. Der genetische Hintergrund, das Alter und das Gewicht der Frau können die Empfindlichkeit gegenüber der Anästhesie beeinflussen. Überwachen Sie die Mäuse während der Operation auf Anzeichen von langsamer Atmung (langsame Atmung bedeutet, dass die Anästhesie zu tief ist) oder Bewegung (Anästhesie ist zu leicht). Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg Körpergewicht) oder Flunixin (2,5 mg/kg) oder ähnliches können gemäß den örtlichen Tierschutzbestimmungen bei Bedarf 8 Stunden nach der ersten Injektion verabreicht werden.
38. Wenn eine andere Frau injiziert werden soll, bereiten Sie den Operationsbereich vor und überwachen Sie das Erwachen der ersten.
    1. Wischen Sie die chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol ab, um jegliches Blut oder Gewebe zu entfernen, und sterilisieren Sie sie im vorgewärmten Glasperlensterilisator für 10 s. Entsorgen Sie die Wattestäbchen und verwenden Sie Seidenpapier. Wischen Sie die Petrischale und die Tonstücke mit Seidenpapier trocken.
39. Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.35, bis alle weiblichen Tiere injiziert wurden.
40. Entleeren Sie die Nadel und entsorgen Sie sie.
    1. Wenn noch ein Virus oder eine Injektionslösung in der Nadel ist, drücke auf dem Nanoinjektor auf Entleeren und leere den Inhalt der Nadel auf Seidenpapier.
    2. Ziehen Sie den Metallstößel vollständig ein, indem Sie Fill drücken, bis ein doppelter Signalton von der Steuerung ertönt, der anzeigt, dass der Stößel vollständig eingefahren ist.
    3. Lösen Sie die Spannzange und schieben Sie die Nadel vom Metallkolben ab. Lege die Nadel in den Abfallbehälter für scharfe Gegenstände.
41. Reinigen Sie die BSL-2-Bank (Biosicherheitsstufe 2).
    1. Wenn ein Virus verwendet wird, besprühe das gesamte Operationsfeld mit Desinfektionsmittel (siehe Materialtabelle). Wischen Sie nach 15 min das Desinfektionsmittel ab und reinigen Sie das gesamte Operationsfeld mit 70% Ethanol. Wenn kein Virus verwendet wurde, reinigen Sie alle Oberflächen mit 70% Ethanol.
    2. Wischen Sie alle PBS-Reste von der Ultraschallsonde mit trockenem, weichem, fusselfreiem Seidenpapier ab.
42. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den Richtlinien für die biologische Sicherheit.
43. Schalten Sie das Ultraschallgerät, den Heiztisch, die BSL2-Bank und die O_2-Versorgung aus.

Ergebnisse

Abbildung 1: Optimale Größe und Ausrichtung der Fruchthöhle für erfolgreiche Injektionen. (A) Uterushorn mit mehreren E7,5-Deziduen, die im Vergleich zum Dickdarm (oben) wie eine Kugelkette geformt sind (unten). (B

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Spritze	BD Bioscience	309628
27 G Nadel	BD Bioscience	300635
3,5 Zoll Kapillaren	Drummond Scientific	3000203G/X	Wurden zum Einziehen von Hausnadeln verwendet
70 MHz MS-Serie Schallkopf	Visual Sonics	MS700
Aquasonic klares Ultraschallgel	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 Mäuse	Charles River, Deutschland	Crl:CD1(ICR)	Weibchen: ab einem Alter von 8 WochenMänner: ab einem Alter von 12 Wochen
Wattestäbchen	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Abrichtzange zart gerade 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ Clips 9 mm	Angthos	59027	Clips
Iris Schere, Super Cut, gerade, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluoran	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Gekauft in der schwedischen Apotheke
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Membranband	Visual Sonics	SA-11053
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-97
Modelliermasse	Sense AB	10209
Maus Handhabungstisch	Visual Sonics	50249
Nanoject II Auto Injector Kit	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Petrischale mit zentraler Öffnung (niedrige Wand)	Visual Sonics	SA-11620
Petrischale, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	Desinfektionsmittel
Silikonmembran	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, Heißperlensterilisator	Angthos	31100
Chirurgisches Klebeband (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Luft & O2) Anästhesiesystem	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Imaging Station 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 Nadel, 45 cm lila Filament	Agnthos	J384H