Gentransfer in Schwann-Zellen des Ischiasnervs der Nagetiere mittels Elektroporation

Zusammenfassung

Quelle: Ino, D. et. al., In vivo Gentransfer to Schwann cells in the Nagetier Isciatic Nerv by Electroporation. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt in vivo den Gentransfer zu Schwann-Zellen des Ischiasnervs von Nagetieren mittels Elektroporation. Eine Plasmid-DNA-Farbstofflösung wird in den Nerv injiziert, und elektrische Impulse erleichtern den DNA-Eintritt. Die DNA integriert sich später in das Genom der Zelle und ermöglicht so einen erfolgreichen Gentransfer in Schwann-Zellen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Präparation von Plasmid-DNA

1. Erzeugung von DNA-Plasmiden für die in vivo-Elektroporation durch Subklonierung der komplementären DNA (cDNA) oder der kurzen Haarnadel-RNA (shRNA) in ein Expressionsplasmid für Säugetierzellen. Verwenden Sie ein Cytomegalievirus-Sofort-Early Enhancer und ein Chicken β-Aktin-Promotor-Fusion (CAG)-Promotor-getriebenes Plasmid, da es eine starke und stabile Expression ermöglicht. Für die Expression von shRNAs unter der Kontrolle eines CAG-Promotors verwenden Sie ein mir30-basiertes shRNA-Kassettensystem zur Subklonierung der shRNA.
2. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Maxi-Prep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren Sie die DNA mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (140 mM Natriumchlorid, NaCl, 0,75 mM Dinatriumhydrogenphosphat, Na2 HPO₄, 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES); pH 7,40). Stellen Sie die DNA-Konzentration auf ≥4 μg/μl ein.
3. Bereiten Sie die Plasmid-DNA-Lösung auf eine Konzentration von 4 μg/μl vor und fügen Sie eine minimale Menge des schnellen grünen Farbstoffs (Endkonzentration von 0,01 %) hinzu, um die Injektionsstelle zu markieren. Wenn eine gleichzeitige Elektroporation mehrerer Plasmide erforderlich ist, stellen Sie die Gesamtkonzentration der Plasmid-DNA-Lösung auf 4 μg/μl ein.
   HINWEIS: Die optimale Zusammensetzung der Plasmid-DNA sollte entsprechend der Transfektionseffizienz jedes Plasmids bestimmt werden.

2. Sterilisation von chirurgischen Instrumenten und chirurgischen

1. Instrumenten aus dem Autoklaven mit Kochsalzlösung und der 0,9%igen NaCl-Lösung.

3. Vorbereitung der Glasmikropipette

1. Ziehen Sie Glaspipetten mit einem Pipettenabzieher. Schneiden Sie die Spitze der Pipette auf einen Durchmesser von 30-50 μm ab. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Wärme, 600; Geschwindigkeit, 50; Zeit, 75.

4. Tierchirurgie, DNA-Injektion und Elektroporation

HINWEIS: Eine Übersicht über diesen Schritt ist in Abbildung 1 beschrieben. Obwohl das Verfahren für Rattenbabys hier beschrieben wird, ist das Verfahren auch auf reifere Tiere anwendbar, die das gleiche Verfahren anwenden.

1. Betäuben Sie die Ratte in der Induktionsbox mit Isofluran, bis das Tier unbeweglich wird, indem Sie den Sauerstofffluss auf 0,4 l/min und die Isoflurankonzentration auf 4 % (vol/vol) einstellen. Führen Sie ein Zehenkneifen durch, um die richtige Anästhesie zu bestätigen.
2. Legen Sie die Ratte unter einem binokularen Mikroskop auf den vorgeheizten Wärmer und halten Sie die Narkose aufrecht, indem Sie kontinuierlich Isofluran über die Gesichtsmaske verabreichen. Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 0,2 l/min und die Isoflurankonzentration auf 2 % (vol/vol) ein. Verwenden Sie Augentropfen, um Trockenheit der Augen zu verhindern, wenn die Augen des Tieres geöffnet sind.
3. Fixieren Sie die Beine mit chirurgischem Klebeband.
4. Reinigen Sie die Haut am hinteren Oberschenkel mit Povidon-Jod und machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell
   HINWEIS: Rasieren Sie Operationsbereiche, wenn sie mit Haaren bedeckt sind.
5. Legen Sie den Ischiasnerv frei, indem Sie mit Nähnadeln eine Öffnung zwischen dem Musculus quadrizeps femoris und dem Musculus biceps femoris schaffen.
6. Befeuchten Sie den Nerv mit 0,9%iger NaCl-Lösung. Nehmen Sie überschüssiges Wasser mit fusselfreiem Papier auf.
7. Führen Sie den Boden einer Mikropipette aus Glas auf einen flexiblen Schlauch ein und füllen Sie die ausreichende Menge DNA-Lösung (mindestens einen Mikroliter) durch vorsichtiges Ansaugen in die Mikropipette.
8. Heben Sie den freiliegenden Nerv an, indem Sie mit einer Nadel vorsichtig an der distalen Seite des Nervs ziehen.
   HINWEIS: Üben Sie keine Spannung auf den Nerv aus, um die mechanische Belastung zu minimieren.
9. Führen Sie die Mikropipette aus Glas in die distale Stelle des Nervs ein und injizieren Sie die DNA-Lösung, indem Sie Druck ausüben (d. h. indem Sie in das offene Ende des flexiblen Schlauchs blasen). Injizieren Sie DNA-Lösung, bis der Nerv grün erscheint (maximal 1 μl). Da häufiges Einführen der Mikropipette den Nerv schädigen kann, führen Sie die Mikropipette nicht mehr als zweimal ein.
10. Platzieren Sie eine Pinzetten-Platinelektrode etwa 1-2 mm vom Nerv entfernt. Füllen Sie den Spalt zwischen Elektrode und Nerv mit 0,9%iger NaCl-Lösung.
    HINWEIS: Halten Sie den Nerv nicht mit der Elektrode fest, um eine mechanische Belastung des Nervs zu vermeiden.
11. Anlegen Sie elektrische Impulse an die Injektionsstelle mit einem Elektroporator mit der Elektrode. Nach dem ersten Impulssatz drehen Sie die Elektrode um und legen einen weiteren Impulssatz an. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Spannung, 50 V; Impulsdauer, 5 ms; Impulsintervall, 100 ms; Impulszahl, 4 mal.
12. Reinigen Sie die Elektroporationsstelle mit 0,9%iger NaCl-Lösung.

5. Nach der Elektroporation

1. Verschließen Sie die Einschnitte mit Cyanacrylatkleber.
2. Nach dem Trocknen des Klebers die Wunde mit Povidon-Jod reinigen.
3. Lösen Sie den Welpen von der Gesichtsmaske. Erwärmen Sie den Welpen mindestens eine Stunde lang auf einem Wärmer, damit er sich vollständig von der Narkose erholen kann.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der in vivo Elektroporationsmethode. Zuerst wird der Ischiasnerv der anästhesierten Ratte freigelegt. Zweitens wird Plasmid-DNA in den Ischiasnerv injiziert. Drittens werden elektrische Impulse durch die zangenförmige...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Genopure plasmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Plasmid DNA-Aufreinigungskit
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Farbstoff für DNA-Injektion
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Glas
Kapillar-Saugschlauch	Drummond	05-2000-00	Saugschlauch für Mikroinjektion
MODELL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	Mikropipettenabzieher
CUY21		CUY21 Einzelzell-Impulsgenerator
Elektrischer Wärmer	KODEN	CAH-6A	Wärmer während der Operation
Isofluolan	Mylan	1119701G1076	Anästhetikum

Einzelzellen-BEX-Elektroporator