Anhaltende Verabreichung des Nervenwachstumsfaktors unter Verwendung eines porösen Siliziumfilms in Ratten-Phäochromozytom-Zellen 12

Zusammenfassung

Quelle: Rosenberg, M., et al. Design von porösen Siliziumfilmen als Träger des Nervenwachstumsfaktors. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Verwendung einer abbaubaren nanostrukturierten porösen Siliziumfolie (PSi) für die verzögerte Freisetzung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) zur Unterstützung der PC12-Zelldifferenzierung. NGF wird durch elektrostatische Wechselwirkungen an den Poren der Folie adsorbiert und durch Diffusion und Gerüstabbau allmählich an das Medium abgegeben. Diese kontrollierte Verabreichung fördert das Überleben der PC12-Zellen und erleichtert das Wachstum und die Verzweigung von Neuriten über einen längeren Zeitraum.

Protokoll

1. Herstellung von Trägern aus oxidiertem porösem Silizium (PSiO₂)

1. Schneiden Sie einen Silizium (Si)-Wafer (einseitig poliert auf der <100>-Oberfläche und stark bordotiert, p-Typ, 0,95 mΩ·cm) in 1,5 cm × 1,5 cm große Proben mit einem diamantbestückten Stift.
2. Die Si-Proben werden in einem Rohrofen bei 400 °C für 2 h in Umgebungsluft oxidiert (Heizrate: 25 °C/min, natürliche Kühlung).
3. Tauchen Sie die Si-Proben 5 Minuten lang in eine Lösung aus wässriger Flusssäure (HF) (48 %), doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 v/v/v). Spülen Sie die Proben dann dreimal mit Ethanol ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrom.
   HINWEIS: Bereiten Sie die HF-Lösung nur in Kunststoffen vor und lagern Sie sie, da HF Glas auflöst.
   VORSICHT: HF ist eine stark korrosive Flüssigkeit und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Im Falle einer Exposition gründlich mit Wasser abspülen und die betroffene Stelle mit HF-Gegenmittelgel behandeln; Suchen Sie sofort einen Arzt auf.
4. Montieren Sie die Si-Probe in einer Polytetrafluorethylen-Ätzzelle, wobei Sie einen Streifen Aluminiumfolie als Rückkontakt und eine Platinspule als Gegenelektrode verwenden.
5. Eine Opferschicht wird in einer 3:1 (v/v) Lösung aus wässrigem HF und Ethanol (99,9 %) 30 s lang bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/cm² geätzt, dann die Oberfläche des resultierenden PSi-Films dreimal mit Ethanol gespült und unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
6. Die frisch geätzte poröse Schicht wird in einer wässrigen Natronlauge (NaOH) (0,1 M) für 2 min aufgelöst. Dann dreimal mit Ethanol spülen und unter einem Stickstoffstrom trocknen.
7. Tauchen Sie die Probe 2 Minuten lang in eine Lösung aus wässrigem HF (48 %), ddH₂O und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 v/v). Dann dreimal mit Ethanol spülen und unter einem Stickstoffstrom trocknen.
8. Die Si-Probe wird in einer 3:1 (v/v) Lösung aus wässrigem HF und Ethanol (99,9 %) für 20 s bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/^cm2 elektrochemisch geätzt, dann die Oberfläche des resultierenden PSi-Films dreimal mit Ethanol gespült und unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
9. Die frisch geätzten PSi-Proben werden in einem Rohrofen bei 800 °C für 1 h in Umgebungsluft (Aufheizrate: 25 °C/min, natürliche Abkühlung) thermisch oxidiert, um ein poröses SiO₂ (PSiO₂)-Gerüst zu bilden.
10. Die PSiO₂ Proben werden 1 min lang mit einem positiven dicken Fotolack bei 4.000 U/min geschleudert, anschließend werden die beschichteten Proben 2 min lang bei 90 °C eingebrannt (Heizrate: 5 °C/min, natürliche Kühlung).
11. Würfeln Sie die PSiO₂ Samples mit einer Würfelsäge in 8 mm × 8 mm Proben.
12. Um den Fotolack zu entfernen, weichen Sie die gewürfelten Proben 3 Stunden lang in Aceton ein, spülen Sie sie dann gründlich mit Ethanol ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl.

2. Beladung von PSiO₂ mit Nervenwachstumsfaktor (NGF)

1. Zur Herstellung der NGF-Ladelösung werden 20 μg murines β-NGF in 400 μl 1:1 (v/v) Lösung von 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und ddH₂O gelöst.
2. Geben Sie 52 μl der Ladelösung auf die PSiO_2-Probe und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) in einer verschlossenen Schale.
   HINWEIS: Halten Sie eine hohe Luftfeuchtigkeit in der Schale aufrecht, um zu verhindern, dass die Lösung während der Inkubation austrocknet.
3. Sammeln Sie die Lösung auf der Probe zur anschließenden Quantifizierung des NGF-Gehalts im PSiO_2-Träger.
   HINWEIS: Die NGF-Beladung in PSiO₂ sollte unmittelbar vor der beabsichtigten Verwendung durchgeführt werden; das Protokoll kann hier aufgrund des Risikos des Austrocknens und der Denaturierung des Proteins nicht unterbrochen werden.

3. Zellviabilität und Zellwachstum in Gegenwart von NGF-beladenen PSiO_2-Trägern

1. Ratten-Phäochromozytom (PC12)-Zellkultur
   1. Bereiten Sie das basische Wachstumsmedium vor, indem Sie 10 % Pferdeserum (HS), 5 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin in das Medium des Roselle Park Medical Institute (RPMI) geben.
   2. Bereiten Sie ein Differenzierungsmedium vor, indem Sie dem RPMI-Medium 1 % HS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin hinzufügen.
   3. Zellsuspension (10⁶ Zellen) in einem 75 cm 2-Kulturkolben mit 10 ml basischem Wachstumsmedium für 8 Tage züchten; alle 2 Tage 10 ml basisches Wachstumsmedium in den Kolben geben.
   4. Um eine differenzierte PC12-Zellkultur zu erzeugen, überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen; zentrifugieren Sie die Zellen für 8 min bei 200 x g und RT. Entsorgen Sie den Überstand.
   5. Die Zellen werden in 5 mL frischem basischem Wachstumsmedium suspendiert und 5 Minuten lang bei 200 x g und RT erneut zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 3 ml basischem Wachstumsmedium resuspendiert.
   6. Um Zellverbände zu trennen, aspirieren Sie die Zellen zehnmal mit einer 23-G-Spritze.
   7. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, einem Zellzähler und säen Sie 10⁴ Zellen/^{cm 2} Arbeitsbereich auf Kollagen Typ I-beschichteten Platten in Gegenwart von Differenzierungsmedium aus.
   8. Nach 24 h frischer muriner β-NGF (50 ng/ml) oder NGF-beladener PSiO_2-Träger pro Platte hinzufügen.
      >HINWEIS: Höhere NGF-Konzentrationen (>50 ng/ml) haben genau die Wirkung wie die angegebene Konzentration.
   9. Erneuern Sie das Differenzierungsmedium alle 2 Tage.
   10. Zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen werden 10 % (v/v) der Viabilitätsindikatorlösung (auf Resazurin-Basis) zu repräsentativen Zeitpunkten zugegeben und 5 Stunden bei 37 °C inkubiert; die Extinktion bei 490 nm mit einem Spektralphotometer gemessen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aceton	Gadot	830101375
Amphotericin	Biological Industries	03-028-1B
Wässriges HF (48%)	Merck	101513
AZ4533 Fotolack	Metal Chem, Inc.	AZ4533
BSA-Fraktion gegen	MP Biomediziner	216006950 BSA-Lösung
(10%)	Biological Industries	03-010-1B
Kollagen Typ l	Corning Inc.
Collagenase	Enco	LS004176
Kollagenbeschichtete Kunststoffdeckgläser	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
Ethanol absolut (99,9%)	Merck	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidin-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Schinkens F-12 Nährstoffmischung	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 Medium	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-Glutamin	Biological Industries	03-020-1A
Murine β-NGF	Peprotech	450-34-20
Normaler Esel Serum (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papain	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7,4)			Hergestellt durch Auflösen von 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O, 18 MΩΗCM).
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
PC12 Zelllinie	ATCC	CRL-1721
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-032-1B
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
PrestoBlue Reagenz	Thermo Scientific	A13261
RPMI Medium	Biologische Industrie	01-100-1A
Si Wafer	Siltronix Corp.		Hoch B-dotiert, p-Typ, 0,00095 Ω cm spezifischer Widerstand, <100>orientiertes
Natriumazid	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
Gerbsäure	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	Nr. 1279

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