Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen Test, dass die Macht der Mikroinjektion mit fluoreszierenden gekoppelt beschäftigt In situ Hybridisierung, um die genaue Messung der Kernexport Kinetik der mRNA in somatischen Zellen von Säugetieren.

Zusammenfassung

In Eukaryoten ist messenger RNA (mRNA) in den Zellkern transkribiert und muss in das Zytoplasma der Übersetzung Maschinen Zugriff exportiert werden. Obwohl die nuklearen Export von mRNA wurde ausgiebig in Xenopus Oozyten ¹ und genetisch manipulierbaren Organismen wie ^Hefe-2 und der Drosophila abgeleitet S2 Zelle Linie ³ studierte, hatten nur wenige Studien in Säugerzellen durchgeführt. Darüber hinaus die Kinetik der mRNA export in somatischen Zellen von Säugetieren können nur geschlossen indirekt ^4,5 sein. Um die Kernexport Kinetik der mRNA in Säugetierzellen Gewebekulturzellen zu messen, haben wir einen Test, der die Macht der Mikroinjektion mit Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) gekoppelt beschäftigt entwickelt. Diese Assays wurden verwendet, um nachzuweisen, dass in Säugerzellen, die Mehrheit der mRNAs in einem Spleißen abhängigen Weise ^6,7 exportiert werden, oder in Art und Weise, dass spezifische RNA-Sequenzen, wie die Signalsequenz kodierende Region (SSCR) ⁶ erfordert. In diesem Test werden die Zellen entweder mit in vitro synthetisierten mRNA-oder Plasmid-DNA mit dem Gen von Interesse mikroinjiziert. Die mikroinjiziert Zellen sind für verschiedene Zeitpunkte dann fixiert und die sub-zelluläre Lokalisation von RNA wird anhand FISH inkubiert. Im Gegensatz zu Transfektion, wo die Transkription erfolgt einige Stunden nach der Zugabe von Nukleinsäuren, ermöglicht die Mikroinjektion von DNA oder mRNA für eine schnelle Ausdruck und erlaubt die Erzeugung von präzise kinetische Daten.

Protokoll

Es gibt zwei Mikroinjektion-basierten Methoden, die verwendet werden, um die Kinetik der mRNA export in Säugetierzellen gemessen werden kann; Injektion von in vitro synthetisierten mRNA oder Plasmid-DNA, die in vivo in mRNA transkribiert wird. Jede Technik hat ihre Vor-und Nachteile. Hier beschreiben wir beide Techniken und diskutieren die Unterschiede zwischen den beiden Ansätzen.

1. Vorbereitung von Materialien für die Injektion

1. In vitro transkribierten mRNA
   1. mRNA wird entweder aus Plasmiden oder PCR-Produkten, die das Gen von Interesse Upstream von den entsprechenden RNA-Polymerase-Promotor (dh T7 oder SP6-Promotoren) flankiert enthalten transkribiert. Die Transkription ist in vitro unter Verwendung des entsprechenden Enzyms (T7 oder SP6 RNA Polymerase, Invitrogen) mit den entsprechenden Nukleotiden und überschüssiges Kappe analogen durchgeführt.
   2. Transkripte sind in vitro polyadenyliert mit Poly-A-Polymerase (Invitrogen) und ATP nach den Protokollen des Herstellers.
   3. Die mRNA wird dann unter Verwendung von Spalten aus entweder Invitrogen oder Qiagen.
   4. Eluiert mRNA sind dann durch Zugabe von 1/20stel Volumen 3M Kaliumacetat und 2 Volumen 100% Ethanol bei -20 ° C für eine Stunde durch Zentrifugation bei 13.000 g bei 4 ° C für 30 Minuten, gefolgt gefällt. Wenn überschüssige Flüssigkeit vorhanden ist, kann das Pellet mit eiskaltem 70% igem Ethanol gewaschen werden.
   5. Die resultierende mRNA Pellet Luft getrocknet in Injektionspuffer (140mm KCl und 10 mM HEPES, pH 7,4) aufgeschlossen. Beachten Sie, dass jede Verunreinigung Ethanol kann giftig sein, um die mikroinjiziert Zelle. Die solubilisierten mRNA kann bei -80 ° C für eine langfristige Lagerung gehalten werden.
   6. Für die Mikroinjektion, ist mRNA verdünnt, um in Injektionspuffer 200μg/ml und mit Oregon Green 488 (OG)-konjugierten 70 kDa Dextran (1mg/ml; Invitrogen). Da die OG-konjugierten Dextran ist zu groß, um über die Kernporen diffundieren, wird es eines nicht nur injizierten Zellen zu identifizieren, sondern auch helfen, zu bestimmen, wie viel von der Flüssigkeit wurde in den Zellkern gespritzt und wie viel durchgesickert in das Zytoplasma (enable siehe 4.1.2). Alternativ kann jeder fluoreszierend, mit hohem Molekulargewicht Molekül, das nicht in der Lage Kernpore Traverse verwendet werden.
   7. Die Proben werden bei 13.000 g bei 4 ° C für mindestens 20 Minuten vor dem Laden der Nadel, um Pellets auf Partikel, die potenziell zu behindern kann die Nadelspitze zentrifugiert.
2. Plasmid-DNA
   1. Plasmid-DNA, die das Gen von Interesse kann unter Verwendung von Standard-DNA-Kits von Qiagen werden. Generell größere DNA-Präparationen neigen dazu, von höherer Qualität sein und sind somit effizienter nach der Injektion transkribiert.
   2. Plasmid-DNA wird 50 bis 200μg/ml verdünnt in Injektionspuffer mit OG-konjugierten 70 kDa Dextran (1mg/ml).
   3. Vor dem Laden der Nadel wird die Injektionsflüssigkeit bei 13.000 g bei 4 ° C für mindestens 20 Minuten zentrifugiert.
3. Nadeln für die Mikroinjektion
   1. Mit einem Sutter p97 Flaming / Brown Micropipette Puller mit einem 2,5-mm-Filament; Nadeln sind aus 1,0 mm Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments Inc. Item # 1B100F-3) hergestellt.
   2. Die Injektionsnadeln sind unter Verwendung eines Drei-Stufen-Ziehen-Programm mit einer 2.5x4.5 mm box Filament (Teil # FB245B, Sutter Instrument Co.). Die Programm-Parameter in diesem Experiment verwendet sind unten aufgeführt, aber sie sollten für jedes Filament optimiert werden.

      Schritt #	Wärme	Ziehen	Geschwindigkeit	Zeit	Druck
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (Ramp Temperatur = 740)
4. Zellpräparation
   1. Generell kann jedes Säugetier-Zelllinie kann mikroinjiziert werden jedoch Zelltypen, die gut verteilt sind, neigen dazu, eher für die Injektion. Die Wahl der Zell-Linie kann auch von anderen Faktoren abhängen. Zum Beispiel, mRNAs, die Code für sezernierte Proteine ​​auf der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums sind gezielte und das ist viel besser sichtbar in COS-7-Zellen zu NIH 3T3-Fibroblasten im Vergleich ⁶ (Vergleich der Lokalisation von t-FTZ-DELTA mRNA in den Abbildungen 3 und 4).
   2. Die Zellen sollten auf acid-washed Platz Deckgläser (25x25 mm) in 30mm Petrischalen für mindestens 24 Stunden vor der Mikroinjektion ausgesät werden. In bestimmten Zelllinien kann die Verbreitung durch Ausplattieren Zellen auf Fibronektin beschichtete Deckgläser ^6,8 stimuliert werden. Idealerweise sollte die zelluläre Monoschicht sollte etwa 70-90% konfluent zum Zeitpunkt der Injektion.
   3. Um eine einfache Identifizierung der injizierten Zellen ist die Zellmonolayer vor der Injektion mit einem 200 ul Kunststoff Pipettenspitze verwundet. Generell ein Kreuz Wunde (Abbildung 1) ist auf dem Deckglas geätzt und die Zellen bleiben für mindestens 15 Minuten vor der Injektion in der Gewebekultur-Inkubator erholen.
   4. Während Mikroinjektion, Gewebekultur-Medien langsam verliert CO _2, um eine Diffusion und als Ergebnis wird Alkali. Zur Aufrechterhaltung eines neutralen pH-Wert während der Injektion, können die Medien mit 10mm HEPES pH 7,4, ergänzt werden. Die zusätzlichen Puffer, um den Medien einen Tag vor der Mikroinjektion hinzugefügt werden.
5. Das Mikroskop und Mikromanipulator
   1. Die Zellen sind Mikroinjektion mit einem inversen Mikroskop, das auf einem Lufttisch isoliert ist, um Vibrationen, die störend auf die Mikroinjektion Prozess minimieren können. Das Mikroskop ist mit zwei Zielen ausgestattet, einem trockenen 10x Stück, mit denen die Zellen und die Nadelposition ist, und einem trockenen 40x extra langem Arbeitsabstand Phase Ziel, die zur Abbildung der Mikroinjektion Prozess ist.
   2. Optische Aberrationen, indem Sie Zellen in der Petrischale und Deckglas verursacht werden, können eliminiert werden, wenn das Ziel hat, eine Korrektur Kragen werden. Sicherstellen, dass die Mikroskops Hellfeld richtig für Köhler Beleuchtung ⁹ ausgerichtet, wird auch Hilfe für Aberrationen, die durch Licht, das durch die Injektionsnadel (siehe 2.2.4) verteilt zu korrigieren.
   3. Die Nadel wird durch einen Drei-Achsen-Joystick hing Mikromanipulation Gerät (NT-88-V3MSH, Narishige) gesteuert. Die groben Manipulator ist auf der Rückseite Säule des Mikroskops befestigt, damit die Nadel leicht angehoben werden und in die Schüssel abgesenkt unter Beibehaltung seiner ursprünglichen Position.
   4. Die Nadel ist ein Zauberstab, der groben Manipulators eingespannt ist gesichert. Ein Rohr verbindet den Zauberstab zu einer 5cc Glasspritze (Item # 512311; Becton Dickinson), die den Einspritzdruck erforderlich, um Flüssigkeit aus der Spitze des Mikroinjektionsnadel eject generiert. Zur Druckregelung Ebene sind die Spritze und Kolben in Position durch eine Spritze Regler, der von zwei Stoppern, eine Rohrschelle (erhältlich in jedem Baumarkt) und zwei Metallklammern (Abbildung 2) besteht statt. Um sicherzustellen, dass die Spritze hohem Druck, Vakuum-Fett (Dow Corning) hält an der Spritze aufgetragen.
6. Die Fluoreszenz-Hybridisierung Probe
   1. Die primäre Folge der injizierten Nukleinsäure gefaltet mittels RNA-Sekundärstruktur Vorhersage-Software, wie RNAstructure 4,6 ^10.
   2. Die mRNA Falten sind visuell beurteilt, um eine Region von etwa 50 Nukleotiden, die frei von sekundären Strukturen mit hohen Schmelztemperaturen, wie lange Doppelstränge neigt zu identifizieren.
   3. Der umgekehrte Ergänzung dieser Region mit einem Alexa546 Fluorophor an das 5'-Ende der Sonde synthetisiert wird (diese können von Integrated DNA Technologies erworben werden).
   4. Die Sonde wird mit Wasser auf eine Konzentration von 100 &mgr; verdünnt und bei -80 ° C für 2-3 Jahre gelagert.

2. Intranukleäre Mikroinjektion

1. Lädt die Injektionsflüssigkeit auf der Mikroinjektion Mikroskop
   1. Etwa 1μl der Injektionsflüssigkeit aus der zentrifugierten DNA oder mRNA Probe unter Verwendung gezogenGELoader Tipps (Item # 022351656; Epindorff). Flüssigkeit sollte von der Spitze der Probe abgesaugt werden, um nicht zu stören das Pellet, die Feinstaub, dass die Nadel verstopfen können, enthält.
   2. Die Spitze der Pipette in das hintere Ende der Nadel gesteckt und die Flüssigkeit wird ausgeworfen. Flüssigkeit an der Nadelspitze durch Kapillarwirkung und einen Meniskus nahe der Spitze sollte innerhalb von 5-30sec sichtbar.
   3. Die mit Flüssigkeit gefüllte Nadel in den Zauberstab, die dann auf den Mikromanipulator wird in einem 45 ° Winkel eingespannt eingefügt.
   4. Die Nadel wird visualisiert mit dem 10fach Objektiv und ist in der Mitte der Betrachtungsebene in der Nähe der Brennebene mit der groben Mikromanipulator Knöpfe positioniert. Die Nadel wird dann ein paar Millimeter angehoben, damit sie nicht in späteren Schritten (2.2.2) beschädigt und dann das Mikroskop wieder Säule nach hinten geschoben zu verhindern.
   5. Der Druck wird durch Drücken der Kolben 0,5-2ml erhöht.
2. Mikroinjektion
   1. Eine Petrischale mit einem Deckglas mit einem verwundeten Monoschicht auf der Betrachtung der Bühne platziert.
   2. Das Mikroskop zurück Säule ist nach vorne in eine aufrechte Position gezogen, wodurch der Kondensator ausgerichtet werden und die Nadel, um die Flüssigkeit geben. Dies sollte sorgfältig durchgeführt werden, um die Nadel vom Brechen auf das Deckglas zu verhindern (siehe 2.1.4).
   3. Mit dem 10fach Objektiv, ist das Zentrum des Kreuzes Wunde identifiziert und die Nadel über den Zellen injiziert werden positioniert.
   4. Die Vergrößerung wird durch die Umstellung auf die 40x-Objektiv und die Nadel wird abgesenkt und zentriert mit dem Feintrieb am Joystick erhöht. Wenn das Bild unscharf ist, muss man sicherstellen, dass das einfallende Licht richtig ausgerichtet ist (dh Kölher Beleuchtung ⁹⁾ mit einem Bertrand-Linse (siehe 1.5.2).
   5. Die Injektion sollte an einer Ecke der Wunde Kreuz beginnen und weiter entlang einer Kante zur einfachen Identifizierung der injizierten Zellen während der Visualisierung (siehe Abbildung 1).
   6. Die Nadel wird abgesenkt, um Kontakt mit dem Kern zu machen. Man kann sich leicht sagen, dass eine Zelle durch die spürbare Veränderung in Phase Helligkeit, dass die Injektion begleitet wurde injiziert.
   7. Wenn die Flüssigkeit füllt die ganze Zelle kann das bedeuten, dass der Druck zu hoch ist und muss gesenkt werden.
   8. Wenn keine Änderung in der Phase Helligkeit erkannt wird, kann dies bedeuten, dass entweder die Mikroinjektion Druck nicht stark genug zu durchdringen die Zellmembran, oder dass die Nadelspitze ist verstopft. Ungenügendem Druck, Fehlstellen in der Nadel und Blockade der Nadelspitze mit kleinen Partikeln: Dies kann die Folge einer Reihe von Themen, darunter sein. Da jedem Laden Nadel in den Mikromanipulator ist zeitaufwendig, und da die Injektion Substrat ist oft sehr wertvoll, ist es wichtig, den Anteil der Nadeln, die effektiv für Injektionszwecke verwendet werden kann maximieren. Unten finden Sie eine Schritt-für Schritt-Anleitung für den Versuch, einen verstopften Nadelspitze zu entsperren. Nach jedem Schritt sollte man versuchen, 2-3cells zu injizieren, um festzustellen, ob Hindernis entfernt wurde:

      	Aktion	Zweck und Ziel
      1	Passen Sie den Fokus auf die Länge der Nadelspitze zu sehen.	Um festzustellen, ob es eine offensichtliche Fehler in der Nadel oder ob es ein großes Stück von Partikeln blockiert die Spitze.
      2	Legen Sie die Nadelspitze an einem schwimmenden Stück Partikel in die Schüssel.	Wenn Flüssigkeit Verlassen der Spitze sollte es das Teilchen ohne sie in direkten Kontakt mit der Nadel zu agitieren.
      3	Drücken Sie den Kolben bis zum Ende der Spritze	Diese vorübergehende Erhöhung des Drucks sollte jegliche Behinderung an der Spitze klar. Nach dem Loslassen des Kolbens, sollte es aus eigenem Antrieb steigen, wenn nicht, bedeutet dies, Druck wird nicht bebauten in die Spritze und die Sie benötigen, um die Verbindungen und / festziehen oder zusätzliche Vakuumfett.
      4	Heben Sie die Nadel aus der Zelle media	Die Kraft der Zeichnung die Nadel aus der wässrigen Medien können helfen verdrängen Hindernisse an der Spitze der Nadel.
      5	Entfernen Sie den Kolben aus der Spritze ganz und wieder einsetzen.	Diese zusätzliche Erhöhung des Drucks erforderlich, um die Spitze der Nadel deutlich werden.
      6	Rubbeln Sie an der Nadelspitze auf einem sauberen Teil des Deckglases	Diese weitere rührt die Partikel innerhalb der Nadel und hilft Neupositionierung er auf ein Hindernis an der Spitze zu entlasten. Stärkere Kratzer können Sie das Ende der Spitze Chip, so dass das Hindernis, um die Nadel zu verlassen.
      7	Legen Sie eine neue Nadel

      
      
      Ein weiteres häufiges Problem ist der allmähliche Verlust der Druck innerhalb der Nadel, die häufigen Kompensation durch weitere deprimierende den Kolben in die Spritze. Oft kann das Hinzufügen von zusätzlichen Vakuum-Fett auf der Spritze zur Erhaltung konsistenter Druck. Doch dieses Problem kann durch Lecks die Verbindungen zwischen Spritze und Schlauch, Rohr und Wand, oder den Zauberstab und die Nadel. Die meisten Leckagen können versiegelt mit Parafilm (Fisher) oder Fett, falls erforderlich, auch wenn Undichtigkeiten zwischen den Zauberstab und Nadel kann nur durch Ändern der Gummidichtung in der wand korrigiert werden.
   9. Cells entlang einer Wundrand entlang der Wundrand für einen festen Zeitraum (10-15min) mikroinjiziert. Mit etwas Übung mehrere hundert Zellen können in diesem Intervall injiziert werden.
   10. Nach Mikroinjektion werden die Zellen bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator für die gewünschte Zeitspanne vor der Fixierung. Gelöst in Nährmedien; Wenn Injektion von DNA wird die Transkription nach 20min durch Behandlung von Zellen mit α-Amanitin (Sigma-Aldrich 1μg/ml) beendet. Diese Konzentration wirksam hemmt Transkription von mikroinjiziert Plasmid (Abbildung 3).
   11. Eine einzige Nadel kann wiederverwendet werden, um mehrere Deckgläser zu injizieren, obwohl die Nadel muss ersetzt, wenn man Veränderungen der Art der DNA oder RNA, ist mikroinjiziert werden. Sobald die Nadel aus der wand entfernt ist, sollte entsorgt werden und nicht wieder verwendet werden.
   12. Dead or schwimmenden Zellen gelegentlich stick an der Nadelspitze und kann mit Mikroinjektion stören. Um diese Trümmer von der Nadel zu entfernen, heben Sie die Nadel aus der Flüssigkeit durch Zurückschieben der Säule und dann langsam wieder einsetzen der Nadel wieder in die Flüssigkeit durch das Nachstellen der Säule in die aufrechte Position.
   13. Um eine genaue Messung der mRNA Kernexport Kinetik-Messung, sollten separate Proben bei 0min fixiert werden, 15min, 30min, 60min und 120min post-RNA Mikroinjektion, oder nach α-Amanitin Behandlung.

3. Zell-Fixierung und Färbung

1. Zellfixierung und Permeabilisierung
   1. Zu gegebener Zeit wird das Wachstum Medien abgesaugt und die Zellen werden zweimal mit 2 ml PBS-Lösung (137mm NaCl, 2,7 KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) gewaschen. Es ist wichtig, die Deckgläser feucht durch die Minimierung der Zeit, die sie nicht in Flüssigkeit eingetaucht zu halten.
   2. Die Zellen werden durch Zugabe von 2 ml 4% Paraformaldehyd (Electron Microscope Sciences) in PBS für mindestens 15min bei Raumtemperatur fixiert.
   3. Die fixierten Proben werden zweimal mit PBS gewaschen.
   4. Die Zellen werden mit 2 ml 0,1% permeabilisierten Triton X-100 in PBS für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   5. Die Proben werden zweimal mit PBS gewaschen.
2. FISH-Färbung
   1. Als nächstes werden die Proben müssen für die Hybridisierung vorbereitet werden. Die Zellen werden zweimal mit 1x SSC-Lösung (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) mit 25-60% formimide gewaschen. Für den Betrag von Formamid, verwenden die gleiche Konzentration, die in der Hybridisierungslösung ist (siehe 3.2.3).
   2. Zur Vorbereitung der Färbung Kammer wird der Boden einer Petrischale 150mm mit Wasser bedeckt und ein Stück Parafilm auf dem Wasser schwamm. Das Wasser wird durch Drehen der Schale über, so dass die Parafilm an den Boden der Schale haften entfernt. Luftblasen sind manuell neuverschoben.
   3. Für jedes Deckglas zu gebeizt, 100 &mgr; Tropfen der Hybridisierungslösung (25-60% Formamid, 100mg/ml Dextransulfat, 1mg/ml E. coli tRNA, 5mM Vanadyl riboside Komplex in 1x SSC mit Sonde verdünnt 1:500) pipettiert werden auf die Parafilm. Beachten Sie, dass die Menge an Formamid für die jeweilige FISH-Sonde verwendet optimiert werden.
   4. Mit Hilfe der Pinzette ist ein Deckglas aus einer 30mm Petrischale entfernt, dann mit Whatman-Filterpapier (VWR) die Rückseite (zellfreien) Seite des Deckglases wird getrocknet und überschüssigen Puffer ist von der Vorderseite bösen ohne Trocknung der festen Zellen. Das Deckglas wird dann Gesicht nach unten auf die FISH-Lösung. Dies ist für jedes Deckglas wiederholt.
   5. Nach dem Einlegen der Färbung Kammer Deckel wieder auf, werden die Proben für 5-18h bei 37 ° C inkubiert
3. Wasch-und Montage der gefärbten Proben
   1. Mehrere Waschen Kammern sind in der gleichen Weise wie die Färbung Kammer (siehe 3.2.2) gemacht.
   2. Für jedes Deckglas wird 1 ml Waschpuffer (1x SCC mit 25-60% Formamid) auf den Parafilm der Waschkammer pipettiert. Verwenden Sie wieder die gleiche Konzentration von Formamid, die in der Hybridisierungslösung ist (siehe 3.2.3).
   3. Zum Entfernen der Deckgläser Färbung Kammer, 1 ml Waschpuffer befindet sich neben dem Deckglas pipettiert. Die Flüssigkeit sollte unter jeder Probe durch Kapillarwirkung gezogen werden.
   4. Mit einer Pinzette werden die Deckgläser entfernt und jeder ist auf den Rückgang von Waschpuffer gelegt und über Nacht bei Raumtemperatur für 5 min.
   5. Schritte 3.3.2 bis 3.3.4 werden noch zweimal wiederholt, so dass jedes Deckglas insgesamt 3-mal gewaschen.
   6. Wenn die RNA wird mit einem Protein in der Immunfluoreszenz costained werden, siehe Abschnitt 3.4.
   7. Slides sind mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet mit Kimwipes. Für jedes Deckglas, ist 10-30 ul der Montage-Lösung mit DAPI (Fluoromount G, Southern Biotech) auf den Objektträger pipettiert. Jede Folie bietet Platz für zwei Deckgläsern.
   8. Mit einer Pinzette und Whatman-Filterpapier, ist die Rückseite der Deckgläser getrocknet und überschüssige Flüssigkeit ist böse von der Vorderseite des Deckglases ohne Trocknung der Proben. Jedes Deckglas wird dann nach unten, auf den Rückgang der Montage-Lösung gelegt.
   9. Mounted Proben lagern bei 4 ° C.
4. Immunfluoreszenzfärbungen
   1. Die Proben müssen zweimal mit PBS gewaschen werden, um Formamid, die mit der richtigen Antikörper-Färbung stören können.
   2. Für jedes Deckglas, 50 ul primärer Antikörper-Lösung (1.0μg/ml Antikörper, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNAse-freies BSA in PBS) auf den Parafilm einer Waschkammer pipettiert.
   3. Mit einer Pinzette werden die Deckgläser Zellen-Seite platziert sich auf dem primären Antikörper-Lösung und ließ sie bei Raumtemperatur für 30min inkubiert.
   4. Für jedes Deckglas, sind zwei 1ml Tropfen PBS auf den Parafilm einer Waschkammer pipettiert.
   5. Zum Entfernen der Deckgläser aus dem Antikörper-Färbung Lösung ist 1 ml PBS pipettiert neben dem Deckglas. Die Flüssigkeit sollte unter jeder Probe durch Kapillarwirkung gezogen werden.
   6. Mit einer Pinzette werden die Deckgläser entfernt und jede gelegt wird auf die ersten Tropfen PBS für 5min und dann platziert auf den zweiten Tropfen PBS für weitere 5min.
   7. Schritte 3.4.2 bis 3.4.6 sind unter Verwendung des fluoreszierenden sekundären Antikörper-Lösung (1.0μg/ml Antikörper, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA in PBS). Beachten Sie, dass seit der Injektion Marker und RNA sichtbar in die grüne und rote Kanal, der sekundäre Antikörper müssen konjugiert werden, um eine kompatible Farbstoff wie Alexa647.
   8. Deckgläser sind in 3.3.7 montiert.

4. Imaging und Quantifizierung

1. Imaging
   1. Ein Epifluoreszenzmikroskop wird verwendet, um Bild die Zellen nach der Injektion. Injizierten Zellen können, indem Sie das Kreuz Wunden und Identifizierung von Zellen mit injiziert Marker (OG-Dextran) befinden.
   2. Für jede Zelle beobachtet, ist ein Bild von der injizierten OG-Dextran erworben. Bei der Abbildung mRNA mikroinjiziert ist es wichtig, dass die Quantifizierung von Zellen, die> 90% der injizierten Flüssigkeit (zB Dextran) in den Kern erhalten ist begrenzt.
   3. Ein Bild der RNA wird dann übernommen. Um für die genaue Messung von RNA, sollte die Belichtungszeit zwischen allen Zellen innerhalb eines bestimmten zeitlichen Verlauf konstant bleiben und fallen in den Dynamikbereich der Kamera. Im Idealfall jedes Bild sollte eine injizierten Zellen in der Lage sein, um eine ordnungsgemäße Berechnung der Hintergrundfluoreszenz intensity (siehe Abschnitt 4.2.4).
   4. Zur Unterstützung bei der Quantifizierung, kann ein Bild der DAPI-Färbung, erworben werden. Auch wenn Immunfluoreszenz durchgeführt wurde, kann die gefärbten Protein auch abgebildet werden. Ein Beispiel für mRNA Verteilung an verschiedenen Punkten in einer Zeit, natürlich ist in Abbildung 4 dargestellt. Die mRNA kodiert ein Protein und wird so auf die ER in COS-7-Zellen gezielt. Beachten Sie, dass die ER-Targeting durch Co-Färbung der RNA mit Antikörpern gegen TRAPα, ein Bewohner ER-Protein ¹¹ wurde überprüft.
2. Quantifizierung
   
   Dies kann mit einer Reihe von verschiedenen Bild-Analyse-Software-Pakete durchgeführt werden. ImageJ-Software ist für die Quantifizierung von zellulären mRNA Verteilung, da es kann verwendet werden, um manuell trennen nukleare und zytoplasmatische Fraktionen gut geeignet sein, kann sie messen die tatsächliche durchschnittliche Fluoreszenz dieser Fraktionen, und ihr Ausgang Daten können leicht kopiert und eingefügt in andere Software, wie z. B. Microsoft Excel.
   1. Bilder entsprechend FISH, OG-Dextran und DAPI-Fluoreszenz geöffnet und zusammengeführt mit dem Bilder auf Werkzeug Stack.
   2. In jedem der DAPI oder Dextran-Schicht das Schwellwert-Werkzeug dient dazu, die Fläche entsprechend der mikroinjiziert Kern zu isolieren. Diese Fraktion wird mit Hilfe der Wand-Werkzeug, und nach dem Umzug der FISH-Schicht, die Fläche (A _Nuc) und mittlere / durchschnittliche Intensität (F _Nuc) werden nach der Werkzeug messen.
   3. Die Zelle Perimeter ist umrissen mit dem Freihand-Auswahl-Werkzeug, und während auf der FISH-Schicht die Fläche (A _Tot) und mittlere / durchschnittliche Intensität (F _Tot) werden nach der Werkzeug messen. Wenn Ihre Zelle Fluoreszenz ist deutlich stärker als die des Hintergrundes, können Sie das Schwellwert-Werkzeug anstelle des Freehand Auswahl-Werkzeug, um die gewünschte Zelle zu skizzieren.
   4. Mit dem Rechteck-Auswahl-Funktion ist eine Box über einen injizierten Zellen und die mittlere / durchschnittliche Intensität (F _Back) aufgezeichnet wird gezeichnet.
   5. Alle Messungen werden auf einem Excel-Arbeitsblatt kopiert.
   6. Exportierte mRNA wird mit Hilfe folgender Gleichung:
      
      

      A Nuc	Die Umgebung des Kerns
      Ein Tot	Bereich der gesamten Zelle
      F Nuc	Durchschnittliche Fluoreszenz der Kern-Fraktion
      F Tot	Durchschnittliche Fluoreszenz der ganzen Zellfraktion
      F Zurück	Durchschnittliche Fluoreszenz von einer nicht transfizierten Zelle

      
      Für jeden Zeitpunkt die durchschnittliche% Export wird berechnet und über der Zeit aufgetragen.
   7. im Laufe der Zeit - die Stabilität der mRNA wird durch Auftragen der durchschnittlichen Gesamt-mRNA-Fluoreszenz (F _Back) A _Tot x (F _Tot) berechnet. In der Regel finden wir die Menge an mRNA stark variiert zwischen Zellen und zwischen Deckgläsern. Dies kann zu Inkonsistenzen zwischen Nadel Flussraten und zwischen der Effizienz der FISH-Färbung.

Abbildung 1. Mikroinjektion Deckglas. Cells angebaut werden, bis sie 70-90% konfluent dann vertikal und horizontal mit einer 200 ul Kunststoff Pipettenspitze verletzt sind. Ausgehend von der Kreuzspulen werden die Zellen entlang einer Wundrand (Pfeil) injiziert.

Abbildung 2. Spritze Regler. A) Flow-Diagramm zeigt, wie die Spritze Regler montiert wird. B) Schematische Darstellung des montierten Geräte. C) Ein Foto von den versammelten Spritze Regler.

Abbildung 3. Auswirkungen von α-Amanitin auf die Transkription von Plasmid-DNA injiziert. NIH3T3 Fibroblasten, die mit unterschiedlicher Konzentration vorbehandelt wurdens von α-Amanitin, wurden mit t-FTZ-DELTA Plasmid-DNA und OG-konjugierten 70kD Dextran injiziert. Injizierten Zellen wurden bei 37 ° C für 1 Stunde und dann fixiert und für t-FTZ-DELTA mRNA mit Hilfe eines spezifischen FISH probe6 gefärbt. Jede Zeile entspricht einem Sichtfeld für OG-70 kDa Dextran und t-FTZ-DELTA mRNA abgebildet. Beachten Sie, dass hoch, aber nicht niedrig, Konzentrationen des Medikaments vollständig gehemmt Herstellung von t-FTZ-DELTA-Transkript. Balken = 15 um.

Abbildung 4. Zeitlicher Verlauf der mRNA Kernexport. COS-7-Zellen wurden mit t-FTZ-DELTA Plasmid-DNA und OG-konjugierten 70kD Dextran injiziert. 30min nach der Injektion wurden die Zellen mit α-Amanitin behandelten und bei 37 ° C für den angegebenen Zeitpunkten. Die Zellen wurden dann fixiert und mit Sonde gegen t-FTZ-DELTA mRNA und mit Antikörpern gegen das ER-Marker TRAPα. Jede Zeile entspricht einem Feld von Zellen. A) mRNA Verteilung nach einer Mikroinjektion Zeitverlauf. B) Ein Schlag auf den 120min Zeitpunkt aus (A) zeigt die Co-Lokalisation von t-FTZ-DELTA mRNA und ER. Eine Überlagerung der t-FTZ-DELTA mRNA (grün) und TRAPα (rot) Färbung ist auf der rechten Seite angezeigt. Maßstabsbalken = 15 um.

Diskussion

Mikroinjektion ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem eine Reihe von verschiedenen zellulären Prozessen untersucht werden können. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zelltransfektion erlaubt Mikroinjektion der Wissenschaftler effektiv einzuführen Nukleinsäuren in die Zellkerne in einem sehr engen Zeitrahmen. Als Ergebnis kann man kinetische Analysen wie die Bestimmung der Preise von mRNA export, mRNA-Lokalisierung, und die Proteinsynthese führen. Darüber hinaus, da der Zeitrahmen des Experiments relativ kurz ist, kann man Zellen toxische Verbindungen innerhalb kurzer Zeitspannen ohne dass pleiotrope Effekte aufzudecken. Darüber hinaus können hemmende oder stimulierende Verbindungen wie dominant negative Proteine, mit der Nukleinsäuren co-injiziert werden. Schließlich vermeiden microinjections die Forderung nach der Transfektion Reagenzien, die oft toxisch für Zellen und können unterschiedliche zelluläre Funktionen stören.

mRNA vs Plasmid-DNA-Injektionen

Die Wahl der Nukleinsäure zu spritzen auf eine Reihe von Überlegungen abhängen wird. Nach Plasmid-DNA Injektion, RNA Polymerase II nicht nur synthetisiert mRNA, sondern auch Rekruten Protein Faktoren, die im Entstehen begriffenen Transkript ^12,13. Da diese Faktoren Veranstaltungen wie mRNA-Prozessierung, nukleare Export und zytoplasmatische Lokalisation regieren, können Plasmid-DNA-Injektionen verwendet werden, um einzuschätzen, wie Transkription, um nachgelagerte Prozesse gekoppelt werden. Obwohl die Transkription zu Kernexport ¹⁴ gekoppelt werden kann, haben wir festgestellt, dass injizierte mRNA etwas schneller als in vivo transkribierten mRNA ⁶ exportiert. Die Gründe dafür sind im Moment nicht klar, aber dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass die neu synthetisierten mRNA von RNA-Polymerase II entsteht, kann es bis in Komplexen, die verzögern Kernexport gebunden werden.

Es gibt einige Vorteile, die mit mRNA Injektionen. Zunächst muss der Forscher nicht zu RNA-Polymerase-Inhibitoren, die beeinflussen könnten, wie Zellen den gesamten Metabolismus von RNA zu regulieren. Zweitens kann die RNA in vitro modifiziert werden, bevor Injektion. Zum Beispiel können mRNAs mit verschiedenen 5'-Cap-Analoga oder Poly (A)-Schwanz Länge synthetisiert werden, um zu beurteilen, wie diese Funktionen nuklearen Export ⁶ beeinflussen. Drittens kann die genaue Menge an RNA, die injiziert wird grob geschätzt werden. Nach dem Protokoll skizzierten schätzen wir, dass etwa 20.000 bis 50.000 Molekülen in jedem Kerne, die relativ klein ist injiziert werden, wenn die Gesamtzahl der Transkripte in einer typischen Säugerzelle (400.000 bis 850.000 Moleküle) ¹⁵ verglichen. Der größte Nachteil mit mRNA-Injektionen besteht darin, dass während der Mikroinjektion, eine Leckage von Injektionsflüssigkeit in das Zytoplasma unvermeidbar ist. Da mRNA direkt in das Zytoplasma injiziert wird über lange Zeiträume (A. Palazzo, unveröffentlichte Beobachtung) stabil ist, muss besonders sorgfältig auswählen, welche Zellen quantifiziert werden. Generell analysieren wir Zellen, die> 90% der Injektionsflüssigkeit in den Zellkern, wie durch die Verteilung der OG-Dextran beurteilt wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Injektionspuffer	Sigma-Aldrich		140 mM KCl und 10 mM HEPES, pH 7,4
Oregon Green 488-70kD Dextran	Invitrogen	D7173	Vorrat von 10mg/ml im Injektionspuffer kann über lange Zeiträume bei -80° gelagert werden C
Kapillarrohre aus Borosilikatglas	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Pipettenspitzen zum Laden von Injektionsnadeln zum Laden von Injektionsnadeln	Eppendorf	022351656
Mikroskop	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Mikromanipulator	Narishige International	NT-88-V3MSH
Spritze zum Spritzen	BD Biosciences	512311
PBS Puffer	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4
SSC-Puffer	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,4
4 % Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	15686	Stamm von 37 % Paraformaldehyd wird in PBS
0,1 % Triton X-100 (Surfact-Amps)	verdünntThermo Fisher Scientific, Inc.	28314	Stamm von 10 % Triton X-100 wird verdünnt in PBS,
Formamid	, Fisher Scientific	F84-1
Dextransulfat	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli tRNA	Sigma-Aldrich	R1753
Vanadyl-Ribosid-Komplex (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Whatman Filterpapier	VWR international	28298-020
Schwingungskontrolltisch	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanitin	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument Co.	P-97
Vakuumfett	Dow Corning	695400008
T7 RNA-Polymerase	New England Biolabs	M0251S
Poly(A)-Polymerase	Ambion	AM1350
Hybridisierungspuffer	Sigma-Aldrich		100 mg/ml Dextransulfat, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, 0,5 mg/ml E. coli tRNA, 60 % Formamid