Genexpression durch Einzelzell-Elektroporation in hippokampalen Schnittkulturen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Keener, D. G., et al. Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Schnittkulturen von erregenden und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen des Hippocampus der Maus. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt den Prozess der Einzelzell-Elektroporation, um Plasmid-DNA in Neuronen in hippokampalen Schnittkulturen von Mäusen einzuführen. Das Verfahren umfasst eine präzise Pipettenpositionierung, Druckanpassungen und Elektroporationsimpulse, um die neuronale Membran vorübergehend zu permeabilisieren und den Gentransfer zu erleichtern. Nach der Elektroporation wird die Scheibe inkubiert, um die Expression des eingeführten Gens von Interesse zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Schnittkultur

1. Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Schnittkulturen der Maus wie zuvor beschrieben vor, indem Sie postnatale 6 bis 7 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwenden.
   Bereiten Sie das
   1. Dissektionsmedium für eine organotypische Schnittkultur vor, bestehend aus (in mM): 238 Saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ und 11 Glukose in deionisiertem Wasser, dann Gas mit 5 % CO₂/95 % O₂ auf einen pH-Wert von 7,4.
   2. Bereiten Sie organotypische Schnittkulturmedien vor, bestehend aus: 78,8 % (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20 % (v/v) Pferdeserum, 17,9 mM NaHCO₃, 26,6 mM Glukose, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES), Insulin (1 μg/ml) und 0,06 mM Ascorbinsäure, pH-Wert angepasst auf 7,3. Stellen Sie die Osmolarität mit einem Osmometer auf 310-330 Osmol ein.
   3. Präparieren Sie Hippocampus aus dem gesamten Gehirn mit zwei Spateln und schneiden Sie mit einem Gewebezerkleinerer (400 μm) in Scheiben. Trennen Sie die Scheiben mit zwei Pinzetten und geben Sie sie auf 30-mm-Zellkultureinsätze in einer 6-Well-Platte, die mit Nährmedien (950 μl) unter den Einsätzen gefüllt ist.
2. Lagern Sie organotypische Schnittkulturen in einem Gewebekultur-Inkubator (35°C, 5% CO₂) und wechseln Sie die Schnittkulturmedien alle zwei Tage.

2. Vorbereitung des Plasmids

1. Bereiten Sie das Plasmid für das gewünschte Gen vor.
   1. Subklonieren Sie das Gen für das verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP) in einen pCAG-Vektor.
   2. Reinigen Sie das pCAG-EGFP-Plasmid mit einem endotoxinfreien Aufreinigungskit und lösen Sie es in einer internen Lösung auf, die aus mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser besteht, das 140 mM K-Methansulfonat, 0,2 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 2 mM MgCl₂ und 10 mM HEPES enthält, angepasst auf pH 7,3 mit KOH (Plasmidkonzentration: 0,1 μg/μl).

3. Vorbereitung der Glaspipette

1. Ziehen Sie Pipetten aus Borosilikatglas (4,5 – 8 MΩ) auf einen Mikropipettenabzieher (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Glaspipetten, die für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen verwendet werden, sind ideal für die Elektroporation.
2. Glaspipetten über Nacht bei 200 °C backen, um sie zu sterilisieren.
3. Überprüfen Sie die Größe der Pipettenspitze unter einem Präpariermikroskop, um den elektrischen Widerstand zu ermitteln.
   1. Optional:Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipettenspitze in filtersterilisiertes künstliches Liquor cerebrospinalis (aCSF) zu manövrieren, das (in mM) enthält: 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ und 11 Glukose in entionisiertem Wasser, vergast mit 5% CO₂/95% O₂ auf einen pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Anzeige am Elektroporator.
      HINWEIS: Je schärfer die Pipettenspitze, desto größer der elektrische Widerstand. Der Pipettenwiderstand sollte unter 10 MΩ liegen. Glaspipetten mit hohem Pipettenwiderstand (Abbildung 1B) verstopfen bei wiederholter Elektroporation häufig an der Spitze.

4. Aufbau des Elektroporations-Rigs

1. Installieren Sie den Elektroporator in einem Standard-Ganzzell-Elektrophysiologie-Rig, das mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet ist, das auf einem Schalttisch montiert ist, einem Mikromanipulator und einer Peristaltikpumpe.
2. Installieren Sie die Kopfstufe des Elektroporators auf einem Mikromanipulator und schließen Sie ein Paar Lautsprecher an den Elektroporator an. Schließen Sie den Elektroporator an ein Fußpedal an, mit dem ein Impuls gesendet werden kann, wenn er bereit ist.
   HINWEIS: Die Lautsprecher geben beim Einschalten einen Ton ab, der den elektrischen Widerstand an der Elektrode anzeigt. Auf diese Weise ist es möglich, relative Änderungen des Widerstands zu bestimmen, ohne die Aufmerksamkeit vom Eingriff abzulenken.

5. Vorbereitung der Elektroporation

1. : Übertragen Sie Scheibenkultureinsätze von 6-Well-Platten auf 3 cm Petrischale, die mit 900 μl Nährmedium beladen und in einem CO₂-Inkubator gelagert werden, bis die Elektroporation durchgeführt werden kann.
   1. Frische Kultureinsätze mit Scheibenkulturmedien (1 ml) für mindestens 30 Minuten in einer 3,5 cm Petrischale vorinkubieren, um die Scheiben nach der Elektroporation zu kultivieren.
2. Reinigen Sie das Bohrgerät und bereiten Sie es für die Elektroporation vor.
   1. Perfundieren Sie die Leitungen 5 Minuten lang mit 10% Bleiche, um den Schlauch und die Kammer zu sterilisieren, bevor Sie das Experiment für den Tag beginnen.
   2. Perfundierten Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit entionisiertem autoklaviertem Wasser, um sie vollständig zu spülen.
   3. Perfundierte der Leitungen mit filtersterilisiertem aCSF, der 0,001 mM Tetrodotoxin (TTX) enthält.
      HINWEIS: TTX minimiert die zelluläre Toxizität und den Tod durch Übererregung der Interneuronen.
3. Stellen Sie die Impulsparameter des Elektroporators ein: Amplitude von 5 V, Rechteckimpuls, Verlauf von 500 ms, Frequenz von 50 Hz und Impulsbreite von 500 μs.
4. Füllen Sie die Glaspipette mit 5 μl plasmidhaltiger interner Lösung.
   Entfernen
   1. Sie alle eingeschlossenen Luftblasen von der Pipettenspitze, indem Sie mehrmals auf die Spitze schnippen und vorsichtig klopfen.
   2. Überprüfen Sie die Spitze auf Beschädigungen, indem Sie sie unter einem Seziermikroskop visualisieren oder indem Sie Schritt 3.3.1 wiederholen, um den Pipettenwiderstand zu überprüfen.
      HINWEIS: Wenn die Spitze beschädigt ist, muss die Glaspipette entsorgt werden, und dieser Schritt muss mit einer neuen Glaspipette wiederholt werden, die zuvor in Schritt 3 hergestellt wurde.
5. Befestigen Sie die Pipettenspitze fest an der Elektrode und schalten Sie die Lautsprecher ein. Notieren Sie die Anzeige (den Widerstand der Pipette) des Elektroporators, wenn die Spitze mit dem aCSF-Medium in Berührung gekommen ist.
6. Schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und isolieren Sie eine Kulturscheibe. Übertragen Sie die Scheibenkultur vorsichtig mit einer spitzwinkligen Pinzette in die Elektroporationskammer und fixieren Sie ihre Position mit einem Scheibenanker.
   1. Bewahren Sie die Scheibenkultur nicht länger als 30 Minuten außerhalb des Inkubators auf, um Nebenwirkungen wie Veränderungen der neuronalen Gesundheit oder Funktion zu vermeiden.

6. Elektroporatzellen von Interesse

:

1. Üben Sie mit dem Mund oder mit einer 1-ml-Spritze (0,2 - 0,5 mL Druck), die am Schlauch befestigt ist, einen positiven Druck auf die Pipette aus.
2. Verwenden Sie die 3-dimensionalen Drehregler des Mikromanipulators, um die Pipettenspitze in die Nähe der Oberfläche der Schnittkultur zu manövrieren.
3. Wählen Sie eine Zielzelle und nähern Sie sich ihr, wobei Sie den positiven Druck beibehalten, bis sich auf der Zelloberfläche ein Grübchen bildet, das unter dem Mikroskop sichtbar ist.
4. Führen Sie Druckzyklen durch.
   1. Üben Sie schnell einen milden Unterdruck mit dem Mund aus, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet, die visuell dadurch angezeigt wird, dass die Membran etwas in die Pipettenspitze eindringt. Beobachten Sie eine Erhöhung des Pipettenwiderstands (~2,5x des Anfangswiderstands), indem Sie auf eine Zunahme des Tons aus den Lautsprechern achten. Üben Sie schnell wieder Überdruck aus, damit sich das Grübchen wieder bildet.
   2. Führen Sie sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen ohne Pause durch und halten Sie dann den Unterdruck für 1 s aufrecht.
      HINWEIS: Eine Pause zwischen den Zyklen, das Ausüben von zu viel Druck oder ein zu langes Halten des Unterdrucks kann zu erheblichen Zellschäden führen und möglicherweise dazu führen, dass die Zelle während der Elektroporation abstirbt.
5. Pulsieren Sie den Elektroporator einmal schnell mit dem Fußpedal, wenn der Ton aus den Lautsprechern einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, der den Spitzenwiderstand anzeigt. Warten Sie nicht länger als 1 s auf den Spitzenwiderstand, bevor Sie den Impuls senden.
   HINWEIS: Wir haben bei Verwendung dieses Protokolls keine Off-Target-Elektroporation beobachtet. Es wurden nur die Zellen transfiziert, die während der Druckzyklen mit der Glaspipette in Kontakt kamen. Die Positionierung der Pipette in der Nähe anderer Neuronen führt nicht zu einer Gentransfektion.
6. Ziehen Sie die Pipette vorsichtig etwa 100 μm von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben.
7. Legen Sie erneut einen positiven Druck an, stellen Sie sicher, dass der Widerstand ähnlich ist wie der in Schritt 5.5 aufgezeichnete Messwert, und nähern Sie sich dann der nächsten Zelle.
   >
   1. Entfernen Sie mögliche Verstopfungen, die visuell oder durch einen deutlich erhöhten (>15% höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie positiven Druck ausüben.
      >HINWEIS: Wenn keine sichtbare Verstopfung vorhanden ist und der Widerstand immer noch deutlich höher ist, entsorgen Sie die Pipette und verwenden Sie eine neue. Im Durchschnitt kann eine Pipette für bis zu 20 Elektroporationsereignisse verwendet werden, wenn der Benutzer vorsichtig ist.
8. Nach der Elektroporation die Scheibenkultur auf einen frischen Kultureinsatz überführen und bis zu 3 Tage bei 35 °C im Inkubator inkubieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zwei repräsentative Bilder von Glaspipetten. (A) Zeigen Sie Pipetten mit niedrigerem Widerstand (6,5 MΩ) an, die in diesem Protokoll verwendet werden, und (B) Pipetten mit höherem Widerstand (10,4...

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