Injektion von selbstorganisierenden Peptiden und neuralen Vorläuferzellen für die Reparatur des Rückenmarks in einem Rattenmodell

Abstract

Quelle: Zweckberger, K., et al. Synergetischer Einsatz von neuralen Vorläuferzellen und selbstorganisierenden Peptiden bei experimentellen zervikalen Rückenmarksverletzungen. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Protokoll demonstriert einen gezielten Injektionsansatz zur Reparatur von Rückenmarksverletzungen in einem Rattenmodell. Dabei werden selbstorganisierende Peptide (SAPs) in den Läsionskern eingebracht, um ein unterstützendes Gerüst zu schaffen, gefolgt von Injektionen von neuralen Vorläuferzellen (NPC) um die Läsion herum, um das Gewebe umzugestalten.

Protocol

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Zervikales Aneurysma-Clip-Kontusions-/Kompressionsmodell

Vor

1. der Operation autoklavieren Sie die Instrumente und halten Sie sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs steril, indem Sie sie in ein Bad mit 70 % Alkohol legen.
2. Betäuben Sie Wistar-Ratten (250-270 g) mit einer Kombination aus Sauerstoff (O₂), Distickstoffmonoxid (N₂O) (1:1) und 1,8-2,2 % Isofluran und unterstützen Sie die Spontanatmung über eine Gasanästhesiemaske. Zur Einleitung der Anästhesie beginnen Sie mit 5% Isofluran für 1 Minute und reduzieren Sie es danach. Kontrollieren Sie vor Beginn der Operation die Narkosetiefe, indem Sie einen schmerzhaften Reiz geben (z. B. an den Pfoten). Tragen Sie Fettsalben in die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden und Folgeinfektionen vorzubeugen.
3. Legen Sie die Ratten auf ein Heizkissen (37 °C) und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen.
4. Den Operationsbereich um die Halswirbelsäule rasieren und mit Povidon-Jod und 70% Alkohol desinfizieren.
5. Machen Sie einen Mittellinienschnitt oberhalb der Wirbelsäule vom Halswirbel (C2) bis zum hervorstehenden Prozessus des Brustwirbelkörpers 2 (T2).
6. Schneiden Sie die äußere Schicht der Wirbelmuskulatur direkt an der Mittellinie (zur Vermeidung von Blutungen) in kranio-kaudaler Richtung durch und präparieren Sie die tieferen Muskelschichten weiter stumpf, bis Sie den Processus spinosus und die Lamellen erreichen. Aufrolleinrichtungen einsetzen.
7. Richten Sie den prominenten Processus spinosus des Wirbelkörpers T2 aus, um die angestrebten Werte für die Laminektomie zu beobachten. Nach Identifizierung und mikrochirurgischer Aufbereitung der selektierten Laminae die Ligamenti flavae durchschneiden, um die Laminae und den Processus spinosus zu lockern. Zum Schluss durchtrennen Sie die Laminae mit einem Knochenschneider lateral des Rückenmarks und entfernen diese vorsichtig, wobei Sie eine Kompression des Rückenmarks selbst vermeiden müssen.
   HINWEIS: Die gebräuchlichsten Ebenen sind C5/6, C6/7 oder C7/T1. Die perioperative Mortalitätsrate steigt, je rostraler das Ausmaß der Verletzung ist. Blutungen aus der paravertebralen Venenhöhle sind häufig und können durch vorsichtige Kompression mit einem Schwamm behandelt werden.
8. Bevor Sie den Clip einführen, um die Nabelschnur zu traumatisieren, identifizieren Sie die entstehenden Nervenwurzeln, um sie vor dem Clipping zu schützen (insbesondere auf den Ebenen C5/6).
9. Um eine reibungslose Clip-Induktion zu gewährleisten, lösen Sie die ventrale Dura mit einem Haken von der dorsalen Seite der Wirbelkörper und bereiten Sie einen Korridor für den Clip vor.
10. Setzen Sie zum Schluss den offenen Clip ein und lassen Sie ihn einrasten (Schnellverschluss), um eine Prellung zu erreichen. Die Schließkraft des Clips und die Dauer des Clip-Verschlusses bestimmen die Intensität des Traumas und das Ausmaß der Kompression. Häufig werden Clipkräfte zwischen 15-35 g und eine Clipdauer von z.B. 1 min. verwendet (Abbildung 1).
11. Nach dem Entfernen des Clips die Muskeln in 2 Schichten anpassen und die Wunde verschließen.
12. Brechen Sie die Narkose ab und lassen Sie das Tier unter Ihrer kontinuierlichen Beobachtung aufwachen, bis es wieder genügend Bewusstsein für die sternale Liege erlangt. Setzen Sie die Ratte schließlich in einen einzigen Käfig und befolgen Sie die Richtlinien für die postoperative Behandlung.
13. Da Tiere mit der Schwere dieser Art von Verletzung zu kämpfen haben, müssen Sie besonders auf postoperative Behandlungen achten:
    1. Verabreichen Sie Schmerzmittel (Buprenorphin und Meloxicam für 3 bzw. 5 Tage und je nach klinischer Symptomatik).
    2. Geben Sie 3 Tage lang (2 mal täglich, 5-10 Milliliter (ml)) zusätzliche Kochsalzlösung subkutan.
    3. Geben Sie 2 Tage vor und bis 7 Tage nach der Operation Antibiotika in das Trinkwasser (z. B. Moxifloxacin)
    4. Drücken Sie die Harnblase 2-3 Mal am Tag zusammen, bis eine Wiederherstellung der Blasenfunktion ständig sichtbar ist.
    5. Beobachten Sie mindestens einmal täglich die neurologischen Defizite und den physiologischen Zustand der operierten Tiere.

2. Injektion von SAPs und NPCs (14 Tage nach der Verletzung)

Einleitung einer

1. Anästhesie wie in 1.1 bis 1.3 beschrieben, Fixieren des Rattenkopfes in einem stereotaktischen Rahmen, Entfernen der Fäden oder Wundklammern und Desinfizieren der Wunde und des Operationsbereichs mit Povidon-Jod und 70%igem Alkohol.
2. Präparieren Sie vorsichtig die paravertebralen Muskeln, setzen Sie Retraktoren ein, entfernen Sie mikroskopisch Narbengewebe aus der Dura und legen Sie die Läsionsstelle wieder frei.
3. Bereiten Sie SAPs in einer Konzentration von 1 % (w/v) vor, um ein extrazelluläres Matrixgel durchzuführen. QL6 SAPs haben einen physiologisch verträglichen pH-Wert und müssen vor der Injektion nicht gepuffert werden. Zur Visualisierung von SAPs im Rückenmark verwenden Sie ein fluoreszierendes Derivat von QL6 (QL6-Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]).
4. Injizieren Sie SAPs (5 Mikroliter (μl) in die Mitte der Läsion, verteilt in 2 Portionen, jeweils 2,5 μl bilateral der Mittellinie. Verwenden Sie eine Hamilton-Spritze, die mit einer Mikroglaskapillare (100 Mikrometer (μm) Außendurchmesser [OD]) mit dem stereotaktischen Rahmen verbunden ist. Öffnen Sie die Dura vorsichtig mit der Spitze einer scharfen Nadel und führen Sie die Glaskapillare stereotaktisch 2 Millimeter (mm) in das traumatisierte Rückenmark ein.
5. Entfernen Sie die Nadel nach der Injektion von 1/3 des Volumens bis zu einer Tiefe von 1,5 mm und nach weiteren 1/3 bis 1 mm. Warten Sie nach der Injektion des gesamten Volumens und vor der Entnahme der Spritze 5 Minuten, um die Gelbildung zu stabilisieren.
6. Um NPCs zu erzeugen, verwenden Sie adulte Diskosoma-Mäuse mit rotem fluoreszierendem Protein (DsRed) (oder gelb fluoreszierendes Protein [YFP]-positiven Mäusen, grün) und isolieren und kultivieren Sie sie aus der paraventrikulären Zone.
7. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit von NPCs durch Trypanblau-Färbung, die das Vorhandensein von ~90% lebenden Zellen in der Zellsuspension anzeigt. Verdünnen Sie die Zellen in einem Wachstumsmedium (50 x 10³ lebende Zellen/μl) und verwenden Sie sie dann für die Zelltransplantation.
8. Nehmen Sie vier intraspinale Injektionen von 2 μl (8 μl Gesamtvolumen, enthalten 4 x 10⁵ NPCs) beidseitig an 2 mm rostral und kaudal der Verletzungsstelle vor. Nach dem Öffnen der Dura die Hamilton-Mikroglaskapillare 1,5 mm unterhalb der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks einführen und 2 μl der Zellsuspension injizieren. Wählen Sie eine Injektionsrate von ca. 0,5 μl /min (min).
9. Warten Sie am Ende jeder Injektion und bevor Sie die Kapillare aus dem Rückenmark entfernen, damit sich das Gewebe dehnen kann, um das neue Zellvolumen aufzunehmen. (Abbildung 2)

Results

Abbildung 1: Modell eines Clip-Aneurysmas mit Prellung/Kompression. (A) Fotografieren Sie durch das Operationsmikroskop nach einer Laminektomie von C7/T1 und einer Clip-Prellung/Kompression des Rückenmarks einer Ratte.

Materials