Optogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise für den Übergang vom Schlaf in den Wachzustand bei Mäusen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Tierchirurgie, Virusinjektion, Elektrode für EEG/EMG und Glasfaserimplantation

VORSICHT: Geeignete Schutz- und Handhabungstechniken sollten basierend auf dem Biosicherheitsniveau des zu verwendenden Virus ausgewählt werden. Adeno-assoziierte Viren (AAV) sollten in einem isolierten P1A-klassifizierten Raum zur Injektion verwendet werden, und das Röhrchen mit AAV muss mit einem Autoklaven sterilisiert werden, nachdem das gesamte Volumen aufgebraucht ist. Die Operationsstelle und das gesamte implantierte Material sollten während des Gebrauchs sauber und steril sein.

HINWEIS: Siehe Abbildung 1.

1. Desinfizieren Sie die chirurgischen Geräte mit dem Autoklaven.

2. Betäuben Sie Mäuse mit Isofluran mit einem Anästhesieverdampfer. Beobachten Sie, bis die Maus die gewünschte Anästhesietiefe erreicht hat, die durch den Verlust der Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes mit einer Pinzette bestimmt wird. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.

3. Das Operationsfeld mit Jodlösung oder 70%igem Ethanol (EtOH, 3x) desinfizieren und ausreichend trocknen. Lassen Sie das Virus während der Operation auf Eis auftauen. Decken Sie den Operationsbereich mit saugfähigem Labortischpapier ab.

4. Fixieren Sie den Kopf der Maus mit Ohrstangen und einer Nasenklemme im stereotaktischen Gerät. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Kopf stabil gehalten wird, machen Sie einen mittleren sagittalen Schnitt in der Kopfhaut, um sicherzustellen, dass sich die Positionen von Bregma und Lambda auf gleicher Höhe auf einer horizontalen Linie befinden.

5. Um eine Positionierungslücke zu vermeiden, passen Sie die Pegel der Nasenklemme und der Ohrbügel entsprechend nach oben und unten an. Das Bregma und das Lambda beziehen sich auf den Schnittpunkt zwischen der Sutura saggitalis und der Sutura coronalis bzw. der Sutura lambdoid (Abbildung 2).

6. Verwenden Sie Serafin-Klemmen, um die Haut zu halten und den Zugang zum Schädel zu erhalten. Desinfizieren Sie nach der Freilegung des Schädels die Schädeloberfläche mit Jod oder 5% H₂O₂, um die Schädelnähte einschließlich Bregma und Lambda besser sichtbar zu machen.

7. Bereiten Sie die AAV-Vektorinjektion vor:

1. Waschen Sie das Innere einer 10-ml-Spritze (siehe Materialtabelle) nacheinander 5 Mal mit 70 % EtOH, 100 % EtOH und sterilisiertem Wasser. Befestigen Sie die Spritze in der Klemme eines Mikroinjektionspumpenarms und stellen Sie sicher, dass die gesamte Lösung in der Spritze abgegeben wird.

2. Aspirieren Sie vorsichtig 2 μL Mineralöl ohne Luftblasen und aspirieren Sie dann das angegebene Volumen der Viruslösung. Betätigen Sie nach der Aspiration den Kolbenknopf und vergewissern Sie sich, dass die Viruslösung an der Nadelspitze austritt.

HINWEIS: Das Injektionsvolumen der Viruslösung wurde in Pilotversuchen mit demselben Mausstamm und demselben Virusprodukt bestimmt. Das Verhältnis zwischen dem Volumen der Viruslösung und der Ausdehnung des Infektionsgebietes sollte im Vorfeld abgeschätzt werden.

8. AAV vector:

1. Passen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel an das Bregma an und notieren Sie sich die Koordinaten als ursprünglichen Punkt. Bewegen Sie die Spitze an die vorgesehene Injektionsstelle (für BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) und platzieren Sie die Spitze der Nadel in dieser Position. Setzen Sie eine Markierung auf den Schädel und bohren Sie Löcher von ca. 2 mm Durchmesser mit einem Zahnbohrer mit einem 0,7 mm Hartmetallfräser. Achten Sie darauf, die Dura oder das Hirngewebe nicht zu beschädigen.

2. Nachdem du mit einem Wattestäbchen Blut aus den Löchern entfernt hast, bewege die Nadel langsam in die Position des BNST. Injizieren Sie langsam die angegebene Menge der Viruslösung (0,07 μl/min) mit einem mechanischen Mikroinjektor. Lassen Sie die Nadel nach Beendigung der Injektion 5 Minuten lang stehen, damit die Lösung ausreichend in das BNST-Gewebe eindringen kann. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel.

3. Für bilaterale Injektionen wiederholen Sie die Schritte 1.8.1-1.8.2 auf der anderen Seite. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs sterile Kochsalzlösung auf, um den Schädel feucht zu halten.

HINWEIS: Wir haben kundenspezifische Elektroenzephalographie (EEG)/Elektromyographie (EMG) Implantate (Breite: 5 mm, Tiefe: 7 mm, Höhe: 1 mm) mit vier EEG-Elektroden (4 mm), zwei EMG-Elektroden (2 mm; die 4-mm-Elektrode mit einer Zange auf 2 mm schneiden) und 6 Elektroden (4,5 mm) verwendet (Abbildung 2A).

9. Löten Sie zwei Edelstahldrähte (siehe Werkstofftabelle), von denen 1 mm der Isolierung an beiden Enden abisoliert wird, an die EMG-Elektroden an. Stellen Sie die Mitte der Elektroden auf das Bregma ein, markieren Sie die Position jeder EEG-Elektrode (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm) und bestimmen Sie die Position des Implantats (Abbildung 2B).

10. Optische Fasern implantieren:

1. Befestigen Sie eine optische Aderendhülse am Manipulator und drehen Sie den Manipulatorarm so, dass er einen Winkel von ±30° gegen eine horizontale Linie hat (dieser Vorgang ist nur erforderlich, um Interferenzen zwischen Elektroden und optischen Fasern zu vermeiden, wie z. B. bei der BNST-Stimulation). Setzen Sie die Faserspitze auf das Bregma und notieren Sie die Koordinaten.

2. Bewegen Sie die Spitze zur angestrebten Einfügelinie und markieren Sie die Position auf dem Schädel. Setzen Sie außerdem zusätzliche Markierungen in der Nähe der Einsteckstelle für die Ankerschrauben. Bohren Sie den Schädel an jeder Stelle mit einem Zahnbohrer, um die Glasfaser einzuführen und die Schraube zu befestigen. Befestige die Schraube am Schädel. Achte darauf, dass du die Dura nicht zerbrichst oder Gewebe mit der Schraube beschädigst.

3. Führen Sie die optische Faser vorsichtig ein, bis sie mit einem Manipulator über den BNST reicht. Die Zwinge sollte auf dem verbleibenden Schädel aufliegen (Abbildung 1B).

4. Tragen Sie lichthärtenden Zahnzement (siehe Materialtabelle) auf, um die Faser und die Schraube zu bedecken. Die Reaktionszeit zum Verfestigen des Klebers sollte durch das Handbuch des Herstellers angegeben werden (Unser Material muss mindestens 10 Sekunden lang mit Photogeneratoren mit bestimmten Wellenlängen beleuchtet werden. Es ist nicht notwendig, den Kleber danach zu trocknen).

5. Stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass keine Materialien (Schrauben oder Kleber) den Montageplatz für die Elektroden einnehmen. Vermeiden Sie außerdem eine Unterbrechung des Zements für die Aderendhülse, die mit der Glasfaser und dem Kabel verbunden ist. Wiederholen Sie die Schritte 1.10.1-1.10.4 auf der gegenüberliegenden Seite für die bilaterale Stimulation.

11. Bohren Sie Löcher für EEG/EMG-Elektroden. Führen Sie die Spitzen der Elektroden in die Löcher ein. Halten Sie das Implantat fest und tragen Sie Cyanacrylatkleber auf den Raum zwischen dem Schädel und den Elektroden auf. Wieder einsetzen und dabei darauf achten, dass keine Materialien in Berührung kommen.

12. Bedecken Sie den Umfang der Elektroden und optischen Fasern mit Cyanacrylatkleber, gefolgt von dem Auftragen des Cyanacrylat-Beschleunigers auf den Klebstoff. Dieser Schritt vermeidet Unterbrechungen im Verbindungsbereich zwischen Ferrule und optischem Kabel und Elektrode und Elektrode und Leitung (Abbildung 1C).

HINWEIS: Cyanacrylat-Klebstoff und sein Beschleuniger sind schädlich für das Mausauge. Achten Sie darauf, dass diese chemischen Substanzen nicht verschüttet werden. Achten Sie außerdem darauf, die Elektroden und die Fasern nicht zu stark zu berühren, um unerwartete Abweichungen unmittelbar nach der Verfestigung des Klebstoffs zu vermeiden.

13. Legen Sie die Halsmuskulatur der Maus frei und führen Sie die Drähte für die EMG-Elektrode unter den Muskel ein. Stellen Sie die Länge der EMG-Elektrode so ein, dass sie sich direkt unter der Nackenmuskulatur befindet. Eine leichte Verbindung zwischen der Elektrodenspitze und der Muskelfaszie reicht aus, um das EMG-Signal abzufangen.

14. Tragen Sie Cyanacrylatkleber auf, um die Implantate zu füllen, und verfestigen Sie den Klebstoff mit Beschleunigungsflüssigkeit. Legen Sie dann die Maus zur Erholung auf ein Heizkissen, bis der Haltungsreflex auftritt. Die Temperatur des Heizkissens an die Körpertemperatur des Tieres anpassen (36,0 °C in ZT 0-12 bei C57BL6-Mäusen; 38,0 °C nicht überschreiten).

HINWEIS: Für eine sterile Operation ist kein Antibiotikum erforderlich. Befolgen Sie die Richtlinien Ihrer örtlichen Institution für die postoperative Analgesie. Halten Sie die Mäuse für eine Erholungsphase von mindestens 7 Tagen in einem Heimkäfig.

2. EEG/EMG-Überwachung mit Photoanregung von Zielneuronen in bestimmten Schlafzuständen

VORSICHT: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Lasergeräten der Klasse 3B oder LED-Geräten. Experimentatoren sollten sich der Sicherheitsinformationen bewusst sein. Eine Schutzbrille ist erforderlich.

1. Bevor Sie das Laserkabel an die Glasfaser anschließen, stellen Sie die Laserintensität mit einem Scaler ein. Befestigen Sie die Spitze des Laserkabels mit einer Aderendhülse an einer unbenutzten Glasfaser und vergewissern Sie sich, dass an der Verbindungsstelle zwischen der Faser und dem Kabel kein Platz ist.

2. Schalten Sie den Hauptschalter des Lasers ein und warten Sie 20 Minuten, bis er sich erwärmt hat.

3. Geben Sie den Laser an den Intensitätsprüfer ab und stellen Sie die Laserintensität auf 10 mW/mm² ein. Ändern Sie den Lasermodus in Transistorlogik und vergewissern Sie sich, dass Lichtimpulse von der Faser emittiert werden, die vom Musterregler gesteuert werden, der auf 10 ms für die Dauer, 40 ms für die Ruhe, 20 Mal für den Zyklus und 20 Mal für die Wiederholung eingestellt ist (d. h. 20 Hz oder 10 ms Lichtimpulse für 20 s).

4. Bringen Sie die Mäuse nach der Erholungsphase in die Versuchskammer, um EEG/EMG aufzuzeichnen. Die Hausmäuse wurden bei konstanten 23 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten, wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen.

5. Schließen Sie die implantierte Elektrode und den Kabeladapter an, der an einem Schleifring befestigt ist, um ein Verheddern zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Verbindungsstelle mit lichtundurchlässigem Material wie Aluminiumfolie abzudecken, um Laserleckagen zu vermeiden. Wenn ein bilateraler Versuch erforderlich ist, verwenden Sie für die Kabel einen Schleifring mit einer gegabelten Befestigung.

6. In diesem Protokoll bewerten wir die Latenzzeit bis zum Wachzustand durch den Schlaf ohne schnelle Augenbewegung (NREM) oder den Schlaf mit schnellen Augenbewegungen (REM), daher sollte die Aufzeichnungszeit in der optimierten Zeitgeberzeit begrenzt werden (ZT0 ist definiert als die Zeit, in der das Licht eingeschaltet ist). Dieses Protokoll wurde zwischen ZT4 und ZT10 durchgeführt. Lassen Sie die Mäuse zur Akklimatisation mindestens 1 h frei in der Versuchskammer bleiben.

7. Überwachen Sie während des Versuchszeitraums EEG- und EMG-Signale im selben Monitor und bewerten Sie den Zustand der Maus als Wachzustand, NREM-Schlaf oder REM-Schlaf. Verwenden Sie den Gain-Regler für jede Welle, um die Unterscheidung der einzelnen Zustände zu erleichtern.

8. Zur Messung der NREM-Schlaf-zu-Wach-Latenz beobachten Sie einen stabilen NREM-Schlaf für 40 s oder einen stabilen REM-Schlaf für 30 s und schalten Sie dann den Schalter des Mustergenerators für die Photostimulation ein (dieses Protokoll erzeugt 20 Hz von 10 ms Lichtimpulsen für 20 s). Bestätigen Sie die Laseremission zu den implantierten optischen Fasern.

9. Nehmen Sie EEG/EMG-Signale auf, bis der Schlafzustand in den Wachzustand wechselt. Wenn zwei oder mehr experimentelle Versuche erforderlich sind, beschränken Sie die optogenetische Manipulation auf einmal täglich, da die Photostimulation ein künstlicher Eingriff ist, der die Schlaf-Wach-Architektur beeinflussen kann.

10. Nach dem Experiment tief anästhesieren und mit steriler Kochsalzlösung und Paraformaldehyd (PFA) durchbluten, um das gesamte Gehirn für die immunhistochemische Analyse zu entnehmen.

Abbildung 1: Verfahren zur Injektion von AAV, zur Implantation von optischen Fasern und EEG/EMG-Implantaten. (A) Experimentelles Verfahren der Virusinjektion. Das EYFP-fusionierte ChR2- oder EYFP-Gen (für die Kontrolle), das in einen AAV-Vektor eingebaut ist, dessen Transkription durch Cre-Rekombinase aktiviert wird, wurde bilateral in den BNST injiziert. (B) Die optischen Fasern wurden in einem Winkel von 30° zur Horizontalen in Richtung BNST eingeführt, um eine Kollision mit der Elektrode zu verhindern. Um ihn herum wurden zwei Schrauben eingesetzt. (C) Ein EEG/EMG-Aufzeichnungsgerät wurde nach sicherer Platzierung der optischen Fasern implantiert. (D) Am Ende der Operation sollte das gesamte Operationsgebiet mit Cyanacrylatkleber abgedeckt und fest fixiert werden. Achten Sie darauf, dass Sie kein Mittel auf den Bereich auftragen, der die Elektrode und die Aderendhülsen verbindet.

Abbildung 2: Benutzerdefinierte EEG/EMG-Elektroden und Elektrodenstifte. (A) Oben: Von 6 Elektrodenstiften werden die äußeren zwei Stifte auf 2 mm gekürzt. Unten: EEG/EMG-Elektroden. (B) Diese Elektroden und EMG-Leitungsdrähte werden dann verlötet. Die Verbindungszone sollte mit einer Isolierung wie Cyanacrylatkleber isoliert werden. Die Insertionsstellen der Elektroden sind relativ zum Bregma (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm). EMG-Drähte werden unter dem Nackenmuskel eingeführt, wobei die Isolierung entfernt wird, die den Draht an der Einführstelle (1 mm) schützt.