Stimulation des Vagusnervs über chronisch implantierte periphere Nervenmanschettenelektroden bei Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Sanchez, C. A., et al. Präparation von peripheren Nervenstimulationselektroden für die chronische Implantation bei Ratten. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Stimulation des Vagusnervs bei einer wachen Ratte. Eine Ratte mit einer implantierten chronischen peripheren Nervenmanschettenelektrode, die in einer Hebeldruckaufgabe trainiert ist, wird über eine implantierte Kopfkappe mit einem Stimulusgenerator verbunden. Der Vagusnerv wird unmittelbar nach jedem erfolgreichen Hebeldruck stimuliert, was zu einer Erweiterung des motorischen Kennfelds führt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Stimulieren der Herstellung von Manschettenelektroden

1. Bereiten Sie den Manschettenschlauch vor.
   1. Schneide mit einer Rasierklinge ein Stück Polymerschlauch von 2,5 mm Länge ab. Führen Sie eine Pinzettenspitzen oder eine Büroklammer durch den Schlauch und bohren Sie mit der Klinge auf einer Seite der Manschette einen Schlitz in Längsrichtung durch die Wand des Schlauchs.
   2. Entfernen Sie die Pinzette aus dem Schlauch und führen Sie eine große Nähnadel senkrecht zur Längsachse durch die Mittellinie der Manschette ein. Führen Sie die Nadel durch den Schlitz (oben) in die Mitte des gegenüberliegenden Schlauchs (unten) ein. Stecken Sie die Nadel in die Schaumstoffplatte, um die Manschette während der restlichen Montageschritte festzustecken.
2. Legen Sie eine Naht, um den Manschettenverschluss während der Implantation zu sichern.
   1. Führe die kleine Nähnadel durch die Wand des Bündchens, an der Mittellinie, etwa 0,5 mm vom oberen Schlitz auf einer Seite entfernt. Führen Sie die Nadel von innen nach außen ein, um eine Beschädigung des Manschettenschlauchs zu vermeiden. Führen Sie eine 2 cm lange Naht 6/0 durch das Nadelöhr ein und ziehen Sie die Nadel durch die Wand des Schlauchs, um die Naht in die Manschette einzufädeln.
   2. Lassen Sie den Faden an Ort und Stelle, entfernen Sie die Nadel und stechen Sie ein zweites Loch durch die Schlauchwand, etwa 0,5 mm unterhalb des ersten Lochs, entlang der Mittellinie der Manschette. Führen Sie die Naht durch das Nadelöhr ein und ziehen Sie die Nadel durch die Schlauchwand, um die Naht erneut durch die Manschette zu fädeln.
   3. Beide Enden des Nahtfadens sollten sich nun auf der Außenseite der Manschette befinden. Passen Sie die Naht so an, dass ~1,5 cm aus dem oberen Loch und ~0,5 mm aus dem unteren Loch herausragen.
   4. Tragen Sie eine kleine Menge UV-härtenden Klebstoffs auf das kurze Ende des Nahtmaterials auf, das sich vom unteren Loch erstreckt, und ziehen Sie am längeren Nahtende, bis das untere Ende fast bündig mit der Außenwand des Schlauchs ist. Verwenden Sie den UV-Stab, um den Klebstoff auszuhärten, und halten Sie die Naht fest an Ort und Stelle.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 auf der gegenüberliegenden Seite der Manschette.
3. Platzieren Sie die Platin:Iridium-Kabel (Pt:Ir).
   1. Benutze die kleine Nähnadel, um 4 Löcher in die Manschettenwand zu bohren. Jedes Lochpaar sollte etwa 0,5 bis 0,8 mm von der senkrechten Mittellinie entfernt platziert werden, wobei ein Loch etwa 0,5 bis 0,8 mm vom oberen Schlitz auf beiden Seiten der Manschette entfernt sein sollte.
      VORSICHT: Für eine möglichst gleichmäßige und genaue Platzierung der Elektroden führen Sie die Nadel von innen nach außen ein, um alle Löcher zu bohren. Verwenden Sie die Nahtplatzierung als Richtlinie.
   2. Führen Sie die Nähnadel erneut ein, diesmal von außen nach innen durch Bleiloch 1. Führen Sie ca. 0,5 cm eines 7,5 cm langen Pt:Ir-Drahtes durch das Nadelöhr ein und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um das Drahtkabel durch die Manschettenwand zu fädeln. Stellen Sie den Draht so ein, dass ~4,5 cm an der Außenseite der Manschette herausragen (Abbildung 1A).
   3. Führen Sie die Nadel erneut durch Bleiloch 1 ein, wieder von außen nach innen, und führen Sie die Nadel zusätzlich durch Bleiloch 2 direkt gegenüber von Bleiloch 1 ein. Führen Sie ~0,5 cm des kürzeren (inneren) Endes des Pt:Ir-Drahtes durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um die Drahtleitung durch die Manschettenwände zu fädeln.
      HINWEIS: Beide Enden des Pt:Ir-Drahtes sollten sich nun auf der Außenseite der Manschette befinden, und eine Drahtschlaufe wird um die Schlitzkante und durch das Anschlussloch 1 gebildet (Abbildung 1B).
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 bis 1.3.3, um den Pt:Ir-Draht durch die Anschlusslöcher 3 und 4 zu führen.
   5. Entfernen Sie mit einem Butanfeuerzeug vorsichtig die Isolierung von einer Länge von 5 bis 6 mm am Ende der Pt:Ir-Drähte, die von der Anschlussöffnung 2 und der Anschlussöffnung 4 ausgehen.
      VORSICHT: Isolieren Sie die Enden der Elektroden vorsichtig vom Rest der Manschettenbaugruppe, um eine Beschädigung der Manschette zu vermeiden. Verwenden Sie Werkzeuge, um die Drähte zu halten, um Verletzungen zu vermeiden.
   6. Richten Sie den blanken Draht in der Manschette aus, um die Elektroden an ihren endgültigen Positionen zu platzieren. Ziehen Sie dazu vorsichtig am Ende des Pt:Ir-Drahtes, der sich von Loch 1 erstreckt, bis der nicht isolierte Teil des Drahtes bündig mit Loch 1 ist. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Leitung, um das nicht isolierte Ende des Drahtes, der durch die Leitungslöcher 3 und 4 gefädelt ist, auszurichten.
   7. Tragen Sie eine kleine Menge UV-härtenden Klebstoffs auf die Drahtschlaufen an der Außenseite der Manschette an den Leitungslöchern 1 und 3 auf. Verwenden Sie den UV-Stab, um den Klebstoff auszuhärten und die Kabel an Ort und Stelle zu befestigen.
   8. Schieben Sie mit einer kleinen Pipettenspitze die nicht isolierten Pt:Ir-Drahtleitungen gegen die Innenwand der Manschette. Sobald die Leitungen angebracht sind, schneiden Sie die Enden der Drähte, die von den Leitungslöchern 2 und 4 ausgehen, so ab, dass etwa 1 mm Draht über die Außenseite der Manschettenwand hinausragt.
   9. Falten Sie die 1 mm langen Enden des Drahtes flach gegen die Außenfläche der Manschette und achten Sie darauf, sie nicht zusammen zu kürzen. Tragen Sie eine kleine Menge UV-härtenden Klebstoff auf, um nur die beiden Schwänze zu bedecken, und härten Sie den Klebstoff aus, um die Elektrodenplatzierung zu sichern und eine elektrische Isolierung zu gewährleisten.
      VORSICHT: Es ist wichtig, die extern freiliegenden Pt:Ir-Oberflächen vollständig mit Klebstoff abzudecken, um die Drähte zu isolieren und eine Stimulation außerhalb des Ziels zu vermeiden.
4. Befestigen Sie die Pt:Ir-Drahtleitungen mit einer Nahtsicherung.
   1. Entferne die große Nadel mit der Manschettenanordnung von der Schaumstoffplatte. Führen Sie eine 3 cm lange Naht 6/0 durch das Nadelöhr ein und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um die Naht in der Mitte durch die Unterseite der Manschette zu fädeln.
   2. Wechseln Sie zur kleinen Nähnadel, um das Einfädeln der Naht für die Pt:Ir-Elektrodensicherung abzuschließen. Führen Sie die Nadel durch das gleiche Mittellinienloch ein und arbeiten Sie erneut von innen nach außen, um eine Verformung des Schlauchs und der Drahtleitungen zu vermeiden. Führen Sie den äußeren Schwanz der Naht durch das Nadelöhr ein und ziehen Sie die Nadel durch die Manschettenwand, um eine Nahtschlaufe um den Rand der Manschette zu erzeugen (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette und arbeiten Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Naht entlang der Längsachse der Manschette ausgerichtet ist und flach am Schlauch anliegt. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Elektroden auf der Innenseite der Manschette getrennt bleiben und seitlich zur Manschettenmittellinie an Ort und Stelle gehalten werden.
   3. Mache eine zweite Schlaufe um das gegenüberliegende Ende der Manschette, indem du die Enden der Naht zu einem halben Knoten an der Außenseite der Manschette bindest. Stellen Sie sicher, dass die Naht entlang der Längsachse der Manschette verläuft und flach am Schlauch anliegt. Während Sie den Knoten festhalten, so dass er flach auf dem Schlauch anliegt, tragen Sie eine kleine Menge UV-härtenden Klebstoff auf den halben Knoten auf und härten Sie ihn aus, um ihn an Ort und Stelle zu halten.
   4. Schneiden Sie die Enden des Nahtfadens vorsichtig so nah wie möglich am Knoten ab. Verwenden Sie bei Bedarf eine kleine Menge zusätzlichen UV-härtenden Klebstoff, um die kurzen Enden des Nahtmaterials so zu verkleben, dass sie flach auf dem Schlauch anliegen (Abbildung 1D).
5. Löten Sie die Steckerstifte an die Pt:Ir-Drahtleitungen.
   1. Entfernen Sie mit einem Butanfeuerzeug die Isolierung von ~3 mm am Ende jedes der Pt:Ir-Drahtleitungen. Löten Sie die Becherseite eines Goldstifts (siehe Materialtabelle) an das nicht isolierte Ende jeder Leitung.
6. Testen Sie die Impedanz des zusammengebauten Geräts.
   1. Verbinden Sie die goldenen Pins mit den Eingängen eines LCR-Messgeräts (Induktivität (L), Kapazität (C) und Widerstand (R)) oder Elektrodenimpedanzprüfmoduls und stellen Sie die Testfrequenz auf 1 kHz ein. Tauchen Sie den Manschettenschlauch (und die Pt:Ir-Stimulationskontakte im Inneren der Manschette) in ein kleines, mit Kochsalzlösung gefülltes Becherglas und achten Sie darauf, die goldenen Bleistifte und Sondenanschlüsse trocken zu halten. Stellen Sie sicher, dass die zusammengesetzte Manschette eine Impedanz von weniger als 2 kΩ bei 1 kHz hat, bevor Sie mit der Implantation fortfahren.
      HINWEIS: Eine hohe Impedanz weist häufig auf eine unzureichende freiliegende Pt:Ir-Oberfläche hin, die aufgrund von Faktoren wie unzureichendem Entfernen der Isolierung, versehentlichem Auftragen von Klebstoff im Inneren der Manschette, gebrochenen Drahtlitzen, etc. Manschetten sollten auch auf gebrochene oder schlecht platzierte Drahtlitzen überprüft werden, die bei längerem Gebrauch zu Kurzschlüssen führen können.

2. Konstruktion der Kopfkappe

HINWEIS: Die Montageverfahren für die Kopfkappe ähneln den zuvor veröffentlichten und werden hier der Einfachheit halber zusammengefasst.

1. Montieren Sie die Kopfkappe
   1. Schneiden Sie zwei kleine Stücke 30 AWG (American Wire Gauge) Drahtwicklung ab, eines ~13 mm lang und eines ~10 mm lang. Entfernen Sie die ~1,5 mm Isolierung an jedem Ende beider Drähte. Löten Sie die Stiftseite eines Goldstifts an ein Ende jedes Drahtes, so nah wie möglich an der Schale. Verwenden Sie einen Drahtschneider, um die überschüssige Länge des Stifts über die Lötstelle hinaus abzuschneiden.
   2. Löten Sie die anderen Enden der AWG-Drähte an die beiden zentralen Lötkelche eines 4-poligen Microstrip-Steckers.
   3. Biegen Sie die Drahtkopfkappe nach oben in Richtung des Steckers, und platzieren Sie die goldenen Stifte flach parallel zueinander gegen den Stecker, wie in Abbildung 2A gezeigt. Der Stift, der mit dem kürzeren Draht verbunden ist, sollte unter dem Stift platziert werden, der mit dem längeren Draht verbunden ist. Verwenden Sie Nagelacryl, Zahnzement oder UV-härtenden Klebstoff, um die Kopfkappenkabel an Ort und Stelle zu befestigen.

3. Verwendung des Geräts

1. Implantieren Sie die Manschettenelektroden für die chronische Vagusnervstimulation.
   HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe sollten in steriler oder aseptischer Technik unter geeigneter Anästhesie in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien (National Institutes of Health) für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit lokaler Genehmigung des IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) durchgeführt werden. Die folgenden Verfahren sollen eine repräsentative Verwendung des Geräts veranschaulichen und erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
   1. Setze die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen und mache einen sagittalen Schnitt über die Parietal- und Hinterhauptknochen, um die Schädeloberfläche für die Implantation der Kopfkappe/des Konnektors freizulegen. Bohren Sie vorsichtig 4 Löcher in den Schädel und setzen Sie die Schrauben des Juweliers ein. Verwenden Sie Zahnacryl, um die Kopfkappe am Schädel und an den Schrauben zu befestigen.
   2. Nehmen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie sie auf die rechte Seite. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Haut auf der linken Seite des Halses und präparieren Sie vorsichtig den linken Vagusnerv von der Halsschlagader, die sich zwischen dem Sternomastoideus- und dem Sternohyoideusmuskel und unterhalb des Musculus omohyoidus befindet.
   3. Der Tunnel führt die Manschette subkutan in Richtung Schädel. Verbinden Sie die Kabel mit den goldenen Stiften mit der Kopfkappe.
   4. Legen Sie den Vagusnerv in die Manschette und befestigen Sie das Gerät, indem Sie einen Doppelknoten in die Manschettennähte binden. Achten Sie darauf, dass der Nerv während der Implantation nicht beschädigt wird, indem Sie den Nerv mit stumpfen, nicht leitenden Haken manipulieren oder das den Nerv umgebende Bindegewebe greifen.
   5. Testen Sie das Implantat, indem Sie das Gerät stimulieren (10 s Zug von 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs biphasische Impulse). Eine ordnungsgemäße Implantation führt zu einem Atemstillstand und einem Abfall des_{SpO 2} (periphere kapilläre Sauerstoffsättigung) um 5 % oder mehr.
   6. Decken Sie die Goldstifte und freiliegenden Elektroden mit Zahnacryl ab, verschließen Sie die Wunden mit Nähten und reinigen Sie die Schnittstellen mit Kochsalzlösung, Alkohol und Povidon-Jod-Lösung.
   7. Bereitstellung von Ersatzflüssigkeiten, Analgetika und postoperativer Versorgung in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien und der IACUC-Zulassung.
2. Stimulieren Sie den Vagusnerv während des Wachverhaltens.
   HINWEIS: Die Verabreichung von VNS (Vagusnervstimulation) bei der Ausführung bestimmter motorischer Aufgaben bei Tieren hat bereits gezeigt, dass sie die motorische Kartendarstellung aufgabenrelevanter Muskulatur erweitert. Wir verwenden dieses validierte Paradigma, um ein repräsentatives Beispiel für die Gerätenutzung zu liefern, aber viele andere Verhaltensparadigmen und/oder Stimulationsparameter können für alternative Anwendungen relevant sein. Die Ratten wurden darauf trainiert, die hier vor der Implantation des Geräts verwendete Hebeldruckaufgabe zu beherrschen. Nach der Operation wurde die gute Leistung vor der VNS-Verabreichung erneut bestätigt: Ratten führten mindestens 100 erfolgreiche Versuche in zwei 30-minütigen Trainingseinheiten pro Tag durch. VNS wurde in 10 aufeinanderfolgenden Trainingseinheiten über 5 Tage mit korrekten Hebeldrücken gepaart.
   1. Verbinde die Ratte über eine implantierte Kopfkappe mit einem Stimulusgenerator und passe sie an die entsprechenden Stimulationseinstellungen an. Für eine VNS-induzierte Reorganisation der motorischen kortikalen Karte koppeln Sie jeden korrekten Hebeldruck mit einer einzigen Folge von 15 biphasischen Impulsen, jeder mit einer Breite von 100 μs und einer Amplitude von 800 μA, die mit einer Frequenz von 30 Hz abgegeben werden.
   2. Ein Stimulationszug wird unmittelbar nach der Erkennung jedes erfolgreichen Hebeldrucks in zehn 30-minütigen Trainingseinheiten abgegeben. Verwenden Sie während der VNS-Verabreichung ein Oszilloskop, um die erfolgreiche Abgabe der Stromstimulation zu überwachen.
3. Validieren Sie die Funktion chronisch implantierter Manschetten.
   1. Innerhalb von 24 Stunden nach der letzten VNS-gepaarten Trainingseinheit kannst du die intrakranielle Mikrostimulation (ICMS) verwenden, um die funktionelle somatotopische Karte im motorischen Kortex zu quantifizieren.
   2. Nach der Einleitung der Anästhesie für die ICMS-Kartierung des motorischen Kortex ist die Funktion der Manschette erneut zu validieren, indem eine 10-s-Stimulation mit einem Strom von 30 Hz und 0,8 mA (100 μs biphasische Impulse) angewendet wird, was zu einem Stillstand der Atmung und einer Verringerung der SpO2-Spiegel um mindestens 5 % führen sollte, was dem Hering-Breuer-Reflex entspricht.
      HINWEIS: Je nach Anwendung kann die Funktion der Manschette als akzeptabel angesehen werden, wenn ein zuverlässiger_{SpO 2-Abfall} von weniger als 5 % beobachtet wird oder wenn höhere Stromamplituden (bis zu 1,6 mA) zuverlässig eine Verringerung des_{SpO 2} um mindestens 5 % bewirken. Das Versäumnis, einen Atemstillstand und/oder eine zuverlässige Abnahme des_{SpO 2} zu beobachten, ist ein Hinweis auf ein Implantatversagen

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Ergebnisse

Abbildung 1: Montage der Stimulationsmanschettenelektroden. (A) Nach dem Befestigen der Nähte auf beiden Seiten der Manschette kann der Pt:Ir-Draht mit einer Nähnadel durch die Manschettenwand bei Loch #1 (weiße Pfeilspitze) gefädelt werden. ...

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