Virusvermittelter Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern der Maus zur lichtinduzierten auditiven Stimulation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kozin, E. D., et.al. Direkte Visualisierung des dorsalen Cochlea-Kerns der Maus zur optogenetischen Stimulation der Hörbahn. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den virusvermittelten Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern (DCN) der Maus, um eine lichtinduzierte auditive Stimulation zu ermöglichen. Ein viraler Vektor, der für Opsin, einen lichtempfindlichen Ionenkanal, kodiert, wird nach einer Kraniotomie und Kleinhirnaspiration in das DCN injiziert, um einen direkten Zugang zu erhalten. Die exprimierten Opsine ermöglichen es, Neuronen durch Licht zu aktivieren, was ein Modell für die Untersuchung von Reaktionen auf Hörbahnen mit Hilfe der Optogenetik darstellt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Zerebelläre Aspiration

Mit einer 5-French-Saugkraft aspirieren Sie den äußersten Teil des linken Kleinhirns, der über dem DCN liegt, bis das DCN sichtbar ist (Abbildung 1, rechtes Bild). Entfernen Sie etwa 1/4 bis 1/3 des linken Kleinhirns. Das wichtigste Wahrzeichen neben dem DCN ist die Ampulle des oberen Bogengangs.
HINWEIS: Die Aspiration des Kleinhirns ist der wichtigste Schritt des Protokolls. Die gerichtete Aspiration des Kleinhirns wird am erfolgreichsten durchgeführt, wenn sie in einem einzigen Versuch und nicht in mehreren Durchgängen der Absaugung erfolgt, da dies zu Blutungen führt. Um die Aspiration zu erleichtern, stellen Sie die Brennebene des Mikroskops auf die erwartete Tiefe des CN ein, die leicht distal zur Oberfläche des Kleinhirns liegt. Wenn Sie die Fokusebene auf den CN einstellen, wird die Visualisierung verbessert und ein scharfes Bild gewährleistet.
Nach der Aspiration sind weitere Blutungen, Liquorbildung (CSF) und Kleinhirnverlagerung auf dem DCN zu erwarten. Träufeln Sie schnell 0,5 ml sterile Kochsalzlösung in die Kraniotomie, um eine Blutgerinnung zu verhindern. Eine Kombination aus sanftem Tupfen mit einer Zahnspitze und Absaugung kann dann verwendet werden, um einen Weg für die direkte Visualisierung des DCN freizumachen. Berühren Sie die Oberfläche des DCN nicht direkt.

2. Druck-Mikroinjektion für den virusvermittelten Gentransfer und die chirurgische Wiederherstellung

Nachdem das DCN frei von darüber liegendem Blut und Liquor und deutlich sichtbar ist, führen Sie mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze über einen Zeitraum von 2 Minuten Druck-Mikroinjektionen in das DCN durch.
Führen Sie die Nadel mit einem Mikromanipulator ein, bis die Spitze unter der Oberfläche des DCN nicht mehr sichtbar ist.
Für eine optimale Leistung verwenden Sie eine 33- oder 34-Gauge-Nadel (verwenden Sie eine gasdichte Spritze mit der 34-Gauge-Nadel) mit einer flachen Abschrägung, z. B. 45°, um ein stumpfes Trauma zu minimieren und das Injektionsvolumen innerhalb des DCN zu lokalisieren, das eine dünne und flache Hirnstammstruktur (<300 μm dick) ist.
HINWEIS: Es können auch andere Mikroinjektionsinstrumente verwendet werden. Im Idealfall sollte das Injektionsinstrument flexibel genug sein, um bei Bedarf eine leichte Biegung zu ermöglichen, um direkt auf das DCN zu zielen. Da sich die Maus während des Eingriffs aufgrund der Atmung leicht bewegt, sollte das Instrument robust genug sein, um geringfügigen Bewegungen standzuhalten.

3. Chirurgische Genesung

Unmittelbar nach der Injektion nähern Sie sich der Haut wieder an und lassen Sie die Maus sich gemäß dem Standard-Erholungsverfahren erholen. Verbleibendes Kleinhirn- und Narbengewebe füllt die durch die Aspiration des Kleinhirns verursachte Höhle auf. Überwachen Sie die Tiere ständig, bis Sie wieder genügend Bewusstsein haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie die Herzfrequenz, die Atemfrequenz sowie die Fütterungsfähigkeit.
HINWEIS: Kein Tier, das operiert wurde, wird mit anderen Tieren in einen Käfig zurückgebracht, bis es sich vollständig erholt hat.
Wenn eine Maus postoperativ (<5 % der Fälle), typischerweise 2-4 Stunden nach dem Verschluss des Hautschnitts, beginnt, im Kreis zu laufen, opfern Sie die Maus sofort, da sie wahrscheinlich Schwierigkeiten beim Fressen haben würde. Diese Nebenwirkung ist wahrscheinlich auf eine Aspiration des Kleinhirns zurückzuführen. Das Tier sollte postoperativ auf Schmerzen überwacht werden, und es sollten geeignete Betäubungsmittel verabreicht werden, um den Komfort der Tiere auf der Grundlage institutioneller Standards zu gewährleisten. Antibiotika können erforderlich sein, wenn Anzeichen einer Infektion vorliegen.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Die partielle Kleinhirnaspiration zeigt den Zugang zum dorsalen Cochlea-Kern. Linkes Bild: Nachdem die Maus in die Halterung eingesetzt wurde, wird ein Schnitt vertikal durch die Haut und das Weichgewebe entlang der hinteren Seite d...