Axonale Regeneration im Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung

1. Materialien und Reagenzien

1. Tiere
   1. Verwenden Sie für die Experimente sechs Wochen alte weibliche CF1-Mäuse mit einem Gewicht von 30–35 g.
      HINWEIS: Die Mäuse wurden in Gruppen (5 Mäuse pro Käfig) in individuell belüfteten, sterilisierten Käfigen mit 1/4" Maiskolbeneinstreu und 2" quadratischen Nestchen zum Nisten untergebracht. Die Käfige wurden in einem kontrollierten 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und die Raumtemperatur lag zwischen 19,4 °C und 25 °C. Die Mäuse wurden mit einer globalen Nagetierdiät und einem automatischen Wasserversorgungssystem gefüttert.
2. Instruments
   1. Verwenden Sie die folgenden chirurgischen Instrumente, um die Operation effizient durchzuführen: Einwegspritzen (27 G, 1,0 mL) für die intraperitoneale Injektion, Fellschere, Stereo-Dissektionsmikroskop, Mikrochirurgie-Pinzetten, Mikrochirurgie-Scheren und kleine Knochenrongeure und sterilisierte Vliesschwämme.
      HINWEIS: Alle Instrumente und Materialien werden vor der Operation autoklaviert oder von den Herstellern vorsterilisiert. Während der Operation werden die Instrumente mit 75%igem Alkohol besprüht, um die Sterilität zu erhalten.
3. Anästhesielösungen
   1. Verwenden Sie Anästhesielösung #1, um die Anästhesie einzuleiten, und verwenden Sie Anästhesielösung #2 vor der Injektion der dorsalen Wurzelganglien (DRG), um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
      1. Um Anästhesielösung #1 herzustellen, verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung in einer Endkonzentration von 10 mg/ml und 1,2 mg/ml.
      2. Um Anästhesielösung #2 herzustellen, verdünnen Sie Avertin in steriler Kochsalzlösung bei einer Endkonzentration von 20 mg/ml.
4. DNA-Plasmid- und RNA-Oligos
   1. Bereiten Sie die Plasmide mit dem kommerziellen Kit entsprechend den Protokollen des Herstellers vor. Verdünnen Sie die Plasmid-DNAs in sterilem deionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 2,0 μg/μl.
   2. Fügen Sie Fast Green Farbstofflösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,005 bis 0,01 % (v/v) zu erreichen, um die DRG-Kontur während der Injektion besser sichtbar zu machen.
   3. Die small interfering RNA (siRNA) oder microRNA-Oligonukleotide (microRNA-Oligos) werden in den entsprechenden vom Hersteller bereitgestellten Puffern gelöst, um eine Endkonzentration von 50 μM zu erreichen.
5. Mikroinjektionspipette
   1. Ziehen Sie das Kapillarglas mit dem Mikropipettenabzieher und schneiden Sie die Spitze der gezogenen Kapillarglaspipette mit einer mikrochirurgischen Schere ab, um eine Öffnung mit einem Außendurchmesser von ca. 50 μm zu erzeugen. Sterilisieren Sie dann die Glaspipette unter UV-Licht auf einer sauberen Bank für ca. 20–30 Minuten.
   2. Montieren Sie die Pipette aus sterilisiertem Glas auf dem Pipettenhalter, der mit einem intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystem verbunden ist. Stellen Sie die Parameter des Mikroinjektionssystems auf 30 psi Druck und 8 ms Dauer ein.
6. Elektroporationssystem
   1. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Rechteck-Elektroporationssystem und stellen Sie die folgenden Parameter ein: 15 ms Impulse bei 35 V mit 950 ms Intervallen für die in vivo Elektroporation.
7. Perfusions- und Fixierlösung
   1. Das Paraformaldehyd (PFA)-Pulver in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 4% (w/v) auflösen. Lagern Sie die PFA-Lösung bei 4 °C.

2. Experimentelle Verfahren

1. Chirurgische Exposition der L4 und L5 DRGs
   1. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion der zuvor hergestellten Anästhesielösung #1 (mit Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 12 mg/kg Körpergewicht).
   2. Rasieren Sie den Operationsbereich mit dem Fellscherer.
      HINWEIS: Da es eine weitere Operation für den linken Ischiasnervenquetsch geben wird, kann das Fell des linken hinteren Oberschenkels gleichzeitig rasiert werden.
   3. Legen Sie die Maus auf die Heizdecke (35,0 °C) und überwachen Sie die Rektaltemperatur mit einem Temperaturfühler.
   4. Um die Anästhesie zu testen, kneifen Sie die Zehen und den Schwanz der Maus zusammen und beobachten Sie die Verhaltensreaktionen.
   5. Klebe die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
   6. Wischen Sie den Operationsbereich mit einer Iodophorlösung ab und verwenden Sie dann 75%igen Alkohol, um den Iodophor zu entfernen, bevor Sie die Haut schneiden.
   7. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
   8. Markieren Sie vor dem Schnitt beide Seiten der Beckenkämme mit einem feinen Filzstift. Zeichnen Sie eine Linie, die die beiden Punkte der Beckenkämme verbindet, um die Position der L5-DRGs leichter identifizieren zu können.
   9. Machen Sie mit einer Mikroschere einen 3 cm langen Schnitt entlang der Mittellinie des unteren Rückens. Darüber hinaus lösen Sie die paraspinösen Muskeln, wie den Musculus multifidus und den Musculus longissimus lumborum, von den Dornfortsätzen L3 bis S1 und legen die Facettengelenke von L4-5 und L5-6 frei.
   10. Verwenden Sie einen Mikrorongeur, um die Facettengelenke von L4-5 und L5-6 zu entfernen. Darüber hinaus wird der linke Neuralbogen von L4 und L5 entfernt, um die dorsale Seite der DRGs freizulegen.
2. DRG Injection
   1. Injizieren Sie eine Anästhesielösung #2 (mit Avertin 200 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal, um die Anästhesie vor der DRG-Injektion aufrechtzuerhalten.
   2. Laden Sie die DNA-Plasmide oder RNA-Oligos (1 μL pro DRG) in die Glaskapillarpipette.
   3. Führen Sie die Spitze der Kapillarglaspipette vorsichtig in die DRG ein.
   4. Injizieren Sie nach und nach 1,0 μl Lösung von DNA-Plasmiden oder RNA-Oligos in das DRG unter Verwendung der intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersysteme (30 psi, 8 ms).
      HINWEIS: Die Dauer der Injektion sollte nicht weniger als 5 Minuten betragen.
3. Electroporation
   1. Tropfen Sie PBS auf die Spitzen der Elektroden.
   2. Reinigen Sie die Blutung mit sterilisierter quadratischer Baumwollgaze.
   3. Kneifen Sie das Ziel-DRG vorsichtig mit den Elektroden zusammen und legen Sie 5 quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporationssystem an.
   4. Verschließen Sie die Muskel- bzw. Hautschichten mit 5-0 Nylonnähten.
   5. Legen Sie die Maus unter strenger Beobachtung auf eine beheizte Decke (35,0 °C), bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus wieder in den Käfig zurück, nachdem sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
      HINWEIS: Es dauert ungefähr 60 Minuten, bis sich die Maus vollständig von der Narkose auf der 37 °C warmen Decke erholt hat. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung auf, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
4. Isiatic Nerve Crush
   1. Zwei oder drei Tage (je nach Versuchsdesign) nach der DRG-Elektroporation die Maus intraperitoneal mit Anästhesielösung #2 (mit Avertin 400 mg/kg Körpergewicht) anästhesieren.
   2. Klebe die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
   3. Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt 0,5 cm nach links entlang der Mittellinie. Schneiden Sie die Muskeln, wie z. B. den Musculus gluteus maximus und den Musculus piriformis, in Längsrichtung ab. Legen Sie das Segment des Ischiasnervs zwischen dem Foramen ischiasis major und der Ischiaskerbe frei.
   4. Quetschen Sie den Nerv mit einer mikrochirurgischen Pinzette für 12 s und markieren Sie die Quetschstelle mit einer 10-0 Nylon-Epineuralnaht. Machen Sie einen Knoten auf der Duralmembran, um die Quetschstelle zu markieren.
   5. Verschließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit einer 5-0 Nylonnaht.
   6. Legen Sie die Maus mit großer Aufmerksamkeit auf eine beheizte Decke (35,0 °C), bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustrolle aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus wieder in den Käfig zurück, nachdem sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
      HINWEIS: Es dauert ungefähr 60 Minuten, bis sich die Maus vollständig von der Narkose auf der 37 °C warmen Decke erholt hat. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung auf, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
5. Mausperfusion, DRG und Ischiasnervenernte
   1. Zwei oder drei Tage nach dem Ischiasnervencrush (je nach Versuchsdesign) betäuben Sie die Maus intraperitoneal mit Anästhesielösung #2.
   2. Perfundieren Sie die Maus transkardial mit PBS (pH 7,4), gefolgt von eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,5) in PBS.
   3. Nach der Perfusion trennen Sie die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und dem Ischiasnerv vor dem Knie vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange unter dem Dissektionsmikroskop. Platzieren Sie den Ischiasnerv direkt in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.
6. Bildgebung und Messung der fluoreszenzmarkierten sensorischen Axone
   1. Entfernen Sie das anhaftende Gewebe und die Membran am fixierten Ischiasnerv vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange unter dem Dissektionsmikroskop. Tauschen Sie dann das 4%ige PFA gegen PBS aus und waschen Sie den Nerv dreimal.
   2. Platzieren Sie den Ischiasnerv auf einer Folie und halten Sie sie gerade. Geben Sie 80 μl Antifading-Lösung um den Nerv herum und legen Sie dann ein Deckglas darauf. Glätten Sie das gesamte montierte Gewebe mit Druck.
   3. Legen Sie das abgeflachte Gewebe auf das inverse Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Zubehör für die Mosaikaufnahme und Bildverarbeitung ausgestattet ist.
      HINWEIS: Die Anregungs- und Emissionslängen betragen 488 nm und 509 nm. Es ist auch möglich, mehrere überlappende Bilder manuell aufzunehmen und die Bilder mit ImageJ mit dem Mosaic-Plug-in zusammenzufügen.
   4. Bei der Messung der Länge der regenerierten Axone ist zu verfolgen, dass alle identifizierbaren fluoreszenzmarkierten Axone im Ischiasnerv von der Quetschstelle (markiert mit der 10-0 epineuralen Naht) bis zu den distalen Axonenden verfolgt werden.