Stereotaktische Transplantation einer neuronalen Zellsuspension in eine Maus mit traumatischer Hirnverletzung

Zusammenfassung

Quelle: Furmanski, O., et al. Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell von Hirnverletzungen bei Mäusen mit therapeutischer Transplantation von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen aus Nervenzellen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video werden humaninduzierte pluripotente Stammzellen aus Nervenzellen stereotaktisch in die Grenze zwischen grauer Substanz und weißer Substanz des tiefen Kortex in einem Mausmodell für traumatische Hirnverletzungen injiziert. Die transplantierten Zellen integrieren sich in das Gewebe und fördern die funktionelle Wiederherstellung und die Reparatur von Schaltkreisen im verletzten Gehirn.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Stereotaktische Transplantation der Zellsuspension

1. : Beginnen Sie die Zelltransplantation etwa 24 Stunden nach der Kraniektomie.
2. Bereiten Sie die Zelltransplantationsausrüstung und das chirurgische Zubehör vor
   1. Füllen Sie eine 1-ml-Slip-Tip-Spritze mit steriler Kochsalzlösung für die Wundspülung. Befestigen Sie eine 25-G-Nadel an der Spritze, um die Spülung zu kontrollieren.
   2. Füllen Sie eine 1-ml-Slip-Tip-Spritze mit CsA-Lösung (Cyclosporin A) zur Immunsuppression. Befestigen Sie eine 25 G Nadel oder größer an der CsA-Spritze. Füllen Sie die CsA-Spritze nach Bedarf zwischen den Operationen nach.
   3. Bereiten Sie Glasnadeln aus Borosilikatglas-Kapillarpipetten mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm mit Standardmethoden vor.
   4. Brechen Sie die Nadelspitzen mit einer feinen Pinzette auf einen Durchmesser von ca. 200 μm. Achten Sie darauf, dass der zylindrische Schaft der Nadel nicht länger als 2,5 cm ist.
3. Kalibrieren Sie die Spritzenpumpe für die Verwendung mit einer 10-μl-Spritze. Geben Sie eine Flussrate von 0,2 μl/min ein, um ein Gesamtvolumen von 2,0 μl zu liefern.
4. Bereiten Sie eine humane induzierte pluripotente Stammzellsuspension (hiPSC) vor.
   1. Führen Sie die gesamte Zellhandhabung in einer Zellkultur-BSL-2-Haube (Biosicherheitsstufe-2) mit Standard-sterilen Handhabungstechniken durch.
   2. Bereiten Sie Zellkulturen im Voraus gemäß den für den Zelltyp definierten Standardbedingungen vor.
      HINWEIS: In den in dieser Demonstration gezeigten Experimenten wurden verschiedene Zellen des neuralen Phänotyps verwendet, die von hiPSCs abgeleitet wurden.
   3. Dissoziieren Sie die Zellen vorsichtig in eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer Zellablösungslösung oder anderer bevorzugter enzymatischer oder chemischer Mittel.
   4. Zählen Sie die Zellen in Suspension und verdünnen Sie die Suspension dann auf 5 x 10⁴ Zellen/μl in minimalem Zellkulturmedium (z. B. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) in einem 1,7 mL Flip-Top-Reagenzglas.
   5. Beachten Sie die folgenden Hinweise für die Transplantation:
      1. Halten Sie die Zellen für die Dauer der Eingriffe bei 37 °C in Schwebe.
      2. Laden Sie die Spritze nur unmittelbar vor der intraparenchymalen Injektion
         HINWEIS: Wenn die Zellsuspension auf die Seite gelegt wird, kann die Schwerkraft dazu führen, dass sie sich an der Seite der Spritze absetzt oder daran haftet, was zu Unregelmäßigkeiten in der Anzahl der injizierten Zellen führt.
      3. Weisen Sie ~5 x 10⁵ Zellen (10 μl Suspension) pro Maus zu, wenn Sie mehrere Zelltransplantationsverfahren an einem Tag durchführen.
5. Führen Sie eine stereotaktische Transplantation durch
   1. Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesie-Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer mit einer komprimierten Sauerstoffquelle verbunden ist. Induzieren Sie eine Anästhesie mit ~3% Isofluran bei ~0,7 l/min Sauerstoff.
   2. Platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit einem angebrachten Anästhesie-Nasenkonus.
      1. Fixiere den Kopf mit Ohrstangen und einer Beißstange und richte den Kopf so aus, dass das Stirnbein des Schädels horizontal ist. Halten Sie die Anästhesie für die Dauer der Operation bei 1,5 % bis 2 % Isofluran.
   3. Führen Sie eine präoperative Pflege und aseptische Vorbereitung durch
      1. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen feuchtigkeitsspendende Augensalbe mit Antibiotika auf die Augen auf.
      2. Spülen Sie die Inzisionsstelle mit steriler Kochsalzlösung, um die Stelle zu reinigen und die Nähte zu lockern. Tragen Sie vorsichtig 70%iges Ethanol mit einem Wattestäbchen auf, um die Inzisionsstelle zu sterilisieren.
   4. Entfernen Sie die Nähte mit einer feinen Pinzette und einer Augenschere. Spülen Sie die Operationsstelle und die Kraniektomie mit reichlich steriler Kochsalzlösung.
      1. Wenn die Hirnrinde disqualifizierende Merkmale aufweist, wie übermäßige Herniation, Verfärbung, gestörte Vaskularisation oder Blutungen, sollte das Tier ausgeschlossen werden.
   5. Laden Sie die Zelltransplantationsspritze
      1. Bewegen Sie die Zellsuspension aus dem 37 °C-Inkubator in eine Biosicherheitshaube der Zellkultur. Schwenken oder klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.
      2. Verwenden Sie eine Mikropipette, um ~7,5 μl Zellsuspension durch das Kolbenende in die Hamilton-Spritze zu laden.
         1. Halten Sie die Spritze in einem Winkel von ~120° mit dem Kolbenende nach unten. Setzen Sie den Kolben ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblase zwischen der Aufhängung und der Kolbenspitze entsteht.
      3. Befestigen Sie die Dichtungsbaugruppe an der Pipettennadel und befestigen Sie die Nadel dann an der Spritze.
      4. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Pipettennadel zu bewegen. Wenn ein Widerstand gegen den Ausfluss der Suspension besteht, brechen Sie die Nadelspitze mit einer feinen Pinzette, um den Durchmesser zu vergrößern.
   6. Befestigen Sie die Spritze an der stereotaktischen Spritzenpumpe. Schieben Sie den Kolben vor, um sicherzustellen, dass die Spritzenpumpenbaugruppe ordnungsgemäß funktioniert.
   7. Bewegen Sie die Nadel in die Koordinaten für die Injektion.
      1. Richten Sie die Nadelspitze an Bregma aus. Legen Sie die X- und Y-Koordinaten auf 0 fest. Bewegen Sie dann die Nadelspitze über die Kraniektomie auf 2,0 mm lateral und -1,0 mm posterior auf das Bregma. Berühren Sie die Nadelspitze mit der Dura-Mater-Oberfläche und stellen Sie die stereotaktische Koordinate auf Z = 0 ein.
      2. Drücken Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension ausreichend fließt, bevor Sie die Nadel in das Gehirn einführen.
      3. Führen Sie die Nadel bis zu einer Tiefe von Z = -1,4 mm in das Gehirn ein. Diese stereotaktischen Koordinaten platzieren das Transplantat an der Grenze zwischen grauer Substanz und weißer Substanz des tiefen Kortex.
   8. Starten Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension zu infundieren. Stellen Sie den Timer für den Labortisch auf 15 Minuten ein und starten Sie den Timer. Verwenden Sie ein Mikroskop mit großem Arbeitsabstand, um den Ausfluss der Zellsuspension zu überwachen.
      1. Spülen Sie die Operationsstelle während der Injektion mit steriler Kochsalzlösung, um die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten.
      2. Nach 15 Minuten ziehen Sie die Transplantationsnadel langsam zurück. Spülen Sie die Operationsstelle mit Kochsalzlösung und schließen Sie den Schnitt mit Nähten.
   9. Führen Sie eine postoperative Pflege durch
      1. Beenden Sie die Anästhesie. CsA durch subkutane Injektion in den Genick in einer Dosis von 10 mg/kg verabreichen. Legen Sie die Maus in einen sauberen und vorgewärmten postoperativen Käfig.
      2. Paracetamol Analgetikum in das Trinkwasser in einer Menge von 1,0 mg/ml geben.
         HINWEIS: Analgesie gemäß dem entsprechenden Standardbetriebsprotokoll (SOP) des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und unter Berücksichtigung experimenteller Ergebnisvariablen verabreichen.
      3. Stellen Sie einen angefeuchteten Käfig zur Rückgewinnung von Futter bereit, um die Rehydrierung und Regeneration zu unterstützen.
6. Setzen Sie die täglichen CsA-Injektionen mit 10 mg/kg während der gesamten Überlebensdauer der Maus fort.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ml Spritzen	Becton Dickinson (BD)	309659
1,7 ml Flip-Top-Reagenzgläser	Denville	C2170
10 Mikroliter Spritze	Hamilton	7635-01
25G Precision Glide Spritzennadeln	Becton Dickinson (BD)	305122
70% Ethanol			Produkt nach Wahl; variiert je nach Region
Paracetamol Suspension zum Einnehmen	Tylenol (Kinder)		In Wasser auf 1 mg/ml verdünnen
Anästhesieverdampfer	Vetland	0521-11-22
Tuch		für den Umgang mit Tieren	Kaufen im Kaufhaus
Betadine	Purdue Produkte	NDC-67618-151-32
Komprimierter Sauerstoff			Produkt nach Wahl; variiert je nach Region
Cyclosporin A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Isolierband	3M Corporation		Kauf im Kaufhaus
Feine Pinzette	Fine Science Tools	11254-20
Pinzette	Fine Science Tools	91106-12
Glaskapillarpipetten, 1 mm AD, 0,58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-3
Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Fräser Set mit 5	Cell Point Scientific	60-1000
Impact One Stereotaxic Impaktor für CCI	Leica Biosystems	39463920
Isofluran	Baxter	NDC-10019-360-60
Labor-Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Mikropipette Abzieher	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Jeder Abzieher genügt
Abdeckgläser für Mikroskope	Fisherbrand	12-545-E
Montagemedium			Produkt nach Wahl
Spiegel			Im Kaufhaus kaufen
Nadelhalter hämostatisch	Fine Science Tools	12002-12
Ophthalmic Salbe	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Ophthalmologische Federschere	Fine Science Tools	15018-10
Kunststoffbox			Kauf im Kaufhaus
Kunststoffzylinder			Kauf im Kaufhaus
QSI motorisierte Spritzenpumpe	Stoelting	53311
Kompressionsverschraubung mit abnehmbarer Nadel	Hamilton	55750-01
Kleiner stereotaktischer Rahmen für Nagetiere	Stoelting	51925
Kleine Schere	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Sterile Alkohol-Vorbereitungspads	Fisherbrand	06-669-62
Sterile Wattestäbchen/Kendall Wattestäbchen	Tyco Healthcare	540500
Sterile Kochsalzlösung	Hospira	NDC-0409-1966-07
Stoppuhren (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold Objektträger	Fisherbrand	15-188-48
Nähte - 5.0 Seide mit gebogener Nadel	Oase	MV-682

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