Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

Zusammenfassung

Quelle: Tagliafierro, L., et al. Lentivirale Vektorplattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-Editing-Werkzeugen in humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Krankheitsmodelle. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) zur gezielten epigenetischen Modifikation von alpha-Synuclein, einem Schlüsselprotein bei der Parkinson-Krankheit. Das Protokoll ermöglicht eine Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung, wodurch die SNCA-Expression für die Untersuchung der Genregulation und möglicher therapeutischer Interventionen reduziert wird.

Protokoll

1. Differenzierung dopaminerger neuraler Vorläuferzellen

1. Auftauen von MD-NPCs (dopaminerge neurale Vorläuferzellen des Mittelhirns)
   1. Bereiten Sie eine mit BMM (basische Matrixmembran) beschichtete Platte vor und erwärmen Sie das vollständige N2B27. Geben Sie 10 mL warmes DMEM/F12 in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Legen Sie ein Kryofläschchen für 2 Minuten in einen 37 °C heißen Heizblock.
      1. Übertragen Sie die Zellen aus dem Kryofläschchen in das Röhrchen mit DMEM/F12. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren.
      2. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml N2B27 und geben Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung der BMM-beschichteten Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂.

2. Transduktion von MD-NPCs und die Analyse von Methylierungsänderungen

1. Transduktion von MD-NPCs
   1. Transduktion von MD-NPCs bei 70% Konfluenz mit LV (lentiviraler Vektor)-Guide-RNA/deaktivierter Cas9-DNMT3A (DNA-Methyltransferase-Enzym 3A) Vektoren bei MOI (Multiplicity of Infection) = 2. Ersetzen Sie das Medium N2B27 16h nach der Transduktion.
   2. Fügen Sie N2B27 mit 5 μg/ml Puromycin 48 h nach der Transduktion hinzu. Kulturieren Sie die Zellen 3 Wochen lang in N2B27 plus Puromycin, um die stabilen MD NPC-Linien zu erhalten. Die Zellen sind bereit für Downstream-Anwendungen (DNA-, RNA-, Proteinanalysen, phänotypische Charakterisierung, Einfrieren und Passaging).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Equipment
15 mL konische Zentrifugenröhrchen	Corning	430791
6-Well-Platten	Corning	3516
Allegra 25R Tischzentrifuge	Beckman Coulter	369434
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Leica	DM IRB2
Zellkulturreagenzien
Antibiotisch-antimykotische Lösung, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Ergänzung (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049