Dieses Video zeigt die Virustransduktion durch In-utero-Injektion in Mausembryonen. Eine trächtige Maus wird auf die Operation vorbereitet, und es wird ein Mittellinienschnitt gemacht, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Eine Mischung aus einem Virus, das das gewünschte Gen enthält, und einem Tracking-Farbstoff wird an den Zielstellen in die Embryonen in den Gebärmuttersäcken injiziert. Die Gebärmutterhörner werden dann vor dem Nähen wieder eingesetzt.
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Methodenartikel
In utero Virustransduktion bei einer Maus
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29. August 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. In-utero-Transduktion
- : Bereiten Sie das Adeno-assoziierte Virus Typ 1 (AAV1) vor, das für das gewünschte Ziel (4 x 10,11 Viruspartikel/μl AAV1) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 kodiert. 0,1 mg/μl Fast Green zugeben und die AAV1-Fast-Green-Mischung bei 37 °C halten.
- Bereiten Sie mit einem Mikropipettenabzieher eine dünne Kapillarspitze in der gewünschten Form (8 mm lang, mit einem Außendurchmesser von 80 μm und einem Innendurchmesser von 50 μm) vor (Einstellungen: Druck = 500, Hitze = 700, Zug = 0, Geschwindigkeit = 80, Zeit = 200, siehe Materialtabelle). Brechen Sie die Spitze der Kapillare so, dass sie 4-5 mm beträgt.
- Setzen Sie ein Absaugrohr (44 cm x 0,7 cm) mit der Kapillarspitze zusammen und aspirieren Sie 15 μL des AAV1-Fast-Green-Gemisches in die Kapillare.
- Halten Sie die Probanden während des gesamten Eingriffs bei einer konstanten physiologischen Körpertemperatur von 37 °C.
- Setzen Sie eine trächtige C57Bl/6-Maus (Embryonaltag 14.5.) in die Vorinkubationskammer und betäuben Sie die Maus mit gasförmigem 4%igem Isofluran (mit einem volumetrischen Luftstrom von 0,6-0,8 l/min).
- Injizieren Sie subkutan Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht).
- Legen Sie die anästhesierte Maus auf die vorgewärmte Operationsplatte (37 °C).
- Bedecken Sie die Augen mit einem Gleitmittel.
- Setzen Sie die Maus mit der Anästhesiemaske (gasförmiges 1,5 % Isofluran bei einem Luftvolumenstrom von 0,6-0,8 l/min) auf die Operationsplatte und rasieren Sie die Bauchhautregion. Wischen Sie die rasierte Stelle mit 3X 75% Ethanol und anschließend mit Betadinlösung ab.
HINWEIS: Überwachen Sie das Atemverhalten der anästhesierten Maus kontinuierlich. Passen Sie die Konzentration des Isoflurangases an das Ein- und Ausatmungsmuster der Maus an. - Überprüfen Sie, ob der Plantarreflex nicht vorhanden ist, indem Sie die Hinterpfotenglieder der Maus zusammendrücken.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie die Haut mit einer gebogenen Zange mit gezackter Iris (10 cm) greifen und die Haut entlang der Linea mediana mit einer geraden Wolframkarbidschere (10 cm) durchtrennen, dann die Bauchwand mit einer geraden Dumont-Pinzette (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) greifen und die Wand entlang der Linea alba mit einer geraden Vanna-Schere (8 cm) durchschneiden.
- Legen Sie ein Stück gefensterte Paraffinfolie auf die Bauchöffnung und befestigen Sie die Folie an beiden Enden mit einer hämostatischen Mikromückenzange (12,5 cm, gebogen).
- Legen Sie die Gebärmutterhörner mit einem löffelartigen Gerät frei, um Schäden an den Embryonen in den Gebärmutterhörnern zu vermeiden. Tropfen Sie ein paar Tropfen PBS (37 °C) auf die Gebärmutterhörner und untersuchen Sie die Embryonen auf Beschädigungen oder Missbildungen im Inneren des Gebärmuttersacks.
- Dokumentieren Sie die Reihenfolge und Position der Embryonen in den Gebärmutterhörnern. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig im Gebärmuttersack, bis die gewünschte Position für die Injektion erreicht ist.
- Injizieren Sie 1-2 μl des AAV1-Fast-Green-Gemisches, indem Sie die Injektionsstelle (z. B. Hirnventrikel) und die Farbstoffpenetration unter einem Stereomikroskop visuell inspizieren.
- Dokumentieren Sie die injizierten Embryonen und legen Sie die Gebärmutterhörner mit den injizierten Embryonen zurück in die Bauchhöhle.
- Tropfen Sie ein paar Tropfen PBS (37 °C) in die Bauchhöhle. Verschließen Sie den Hohlraum, indem Sie die Peritonealwand (verwenden Sie Nähte der Größe Polyamid 6-0) und die Haut (Nähte der Größe Polyamid 3-0) mit der hämostatischen Zange von Halsted (12,5 cm, gebogen) nähen. Alternativ können Sie ein einfaches unterbrochenes Muster oder Edelstahlnähte/-klammern verwenden, um die Bauchhöhle und die Haut zu schließen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 26Gx 1'' Nadel | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anästhesieeinheit für Luftpumpe | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-assoziiertes Virus Serotyp 1 (AAV1) | UKE (Viral Für | Referenzen und Zielbereiche von AAV1 siehe: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ und auch: Designer Gene Delivery Vectors: Molecular Engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 März; 25(3):489-99. Rekombinante AAV-Virusvektoren, die mit viralen Kapsiden der Serotypen 1, 2 und 5 pseudotypisiert wurden, zeigen nach der Verabreichung an verschiedene Regionen des Zentralnervensystems eine unterschiedliche Effizienz und einen unterschiedlichen Zelltropismus. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug; 10(2):302-17. Selbstkomplementäre rekombinante rekombinante Adeno-assoziierte Viren (scAAV)-Vektoren fördern eine effiziente Transduktion unabhängig von der DNA-Synthese. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug; 8(16):1248-54. | |
| Luftpumpe | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | Eheim 100 | |
| Aspirator Tune Assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Atemmaske Maus Eloxiertes Aluminium | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | - | |
| Buprenorphin | Temgesic | Ampullen | Schmerzmittel |
| Kapillaren | Science-Produkte | GB100TF-10 | mit fillament |
| Dumont Pinzette (#3, 12 cm, gerade, 0,2 x 0,12 mm) | FST | 11203-23 | |
| Elektrorasierer | Phillips | - | |
| Ethicon Nähte (Ethilon, 6-0 und 3-0) | Ethicon-Polyamid | ||
| Augengleitmittel | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | zur Visualisierung von injizierten Flüssigkeiten |
| Gas Routing Switch 4/2 Anschlüsse | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | 8433020 | |
| Halsted Mosquito hämostatische Pinzette (12,5 cm, gerade) | FST | 13011-12 | |
| Induktionsbox für Mäuse mit horizontal beweglichem Deckel.Innenmaße: LxBxH: 155x115x130 mm.Wandstärke: 6 mm | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | - | |
| Iriszange (10cm, gebogen, gezahnt) | FST | 14007-14 | |
| Irisschere (11cm, gerade, Wolframkarbid) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, elektrisch beheizt, smAußenmaße: 257x110x18 mm.Heizfläche: 190x90 mmDie Entfernung des aus der Atemmaske austretenden Isoflurans erfolgt nach unten in Übereinstimmung mit den Vorschriften | Biomedizinische Instrumente (Univentor) | - | |
| Isofluran (Attan) | JD medizinische | Inhalationsanästhesie | |
| Lichtmikroskop Basic DM E | Leica-4x | (N.A. 0,1 ∞/-), 10x (N.A. 0,22 ∞/0,17), 40x (N.A. 0,65 ∞/0,17), 100x (N.A. 1,25 ∞/0,17) | |
| Objektive Mikropipette ziehen | Science-Products | P-97 | |
| Moskito-Hämostativzange (12,5cm, gebogen) | FST | 13010-12 | |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | ||
| Tygon 6/4 Schlauchmaterial zum Verbinden aller TeileAußendurchmesser: 6mmInnendurchmesser: 4mmWandstärke: 1mm | Biomedical Instruments (Univentor) | ||
| Vannas Schere (8 cm, gerade) | FST | 15009-08 |
