Stereotaktische Injektion von Hydrogel in ein Mausmodell nach einem Schlaganfall

Zusammenfassung

Quelle: Wilson, K.L., et al. Injektion von Hydrogel-Biomaterial-Gerüsten in das Gehirn nach einem Schlaganfall. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Hydrogels in den Schlaganfallkern einer Maus nach einem Schlaganfall und unterstreicht seine Rolle bei der Gerüstbildung, die die extrazelluläre Matrix nachahmt, die zelluläre Infiltration fördert und die Angiogenese unterstützt, was sein neurotherapeutisches Potenzial bei der Schlaganfallgenese unterstreicht.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

Injektion von Hydrogel oder anderen Biomaterialien

1. Führen Sie die Injektion von Biomaterialien zu einem benutzerdefinierten Zeitpunkt durch. In diesem Experiment wurden die Injektionen zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Schlaganfall durchgeführt. 2 - 6 μl Hydrogel werden injiziert.
   1. Schalten Sie das Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose (37 °C) zu halten.
   2. Bereiten Sie autoklavierte Scheren, Pinzetten, Baumwolle, Tierarztaugensalbe, chirurgischen Kleber oder Nahtmaterial, sterilen Alkohol und Beta-Jod-Tücher vor. Bereiten Sie den Knochenbohrer mit sterilen Bohrerköpfen und die 25 μl Glasspritzen von Hamilton mit 30 G-Nadeln aus Metall vor.
   3. Schalten Sie die Bead-Sterilisation auf 160 °C ein, um die Sterilisation von Instrumenten zwischen Mäusen zu ermöglichen.
   4. Befestigen Sie die Einspritzpumpen an der stereotaktischen Vorrichtung. Stellen Sie die Durchflussrate auf 1 μl/min und das Volumen auf 4 μl ein.
   5. Bereiten Sie nach der Operation einen sauberen Käfig für die Mäuse vor.
2. Setzen Sie die Maus mit einer Isoflurankonzentration von 4 % in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung aufhört und ihre Atmung zu einem langsamen, gleichmäßigen Rhythmus kommt.
   1. Sobald Sie schlafen, übertragen und sichern Sie die Maus auf das stereotaktische Gerät mit einer Erhaltungsisoflurankonzentration von 1,5%.
   2. Tragen Sie die Tierarzt-Augensalbe auf beide Augen auf.
   3. Rasieren Sie das Fell, das vom Kopf der Maus nachgewachsen ist, und bereiten Sie den Bereich aseptisch vor, indem Sie ein Alkoholtuch gefolgt von einem Beta-Jod-Tuch verwenden. Wiederholen Sie dies dreimal.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf am Ende ein zusätzliches Alkoholtupfer, um das gesamte Beta-Jod zu entfernen, da es Hautreizungen verursacht und dazu führt, dass die Mäuse nach der Operation ihren Schädel jucken.
3. Öffnen Sie mit der kleinen Schere und/oder Pinzette die Haut über dem Gehirn wieder. Verwenden Sie Watte mit steriler Kochsalzlösung oder PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), um den Schädel von Ablagerungen zu befreien. Zu sehen sind ein weiß-gelber Kreis (der Strich, Abbildung 1B) und das Fräsloch des Bohrers. Wenn das abgestorbene Gewebe nicht sichtbar ist, ist wahrscheinlich kein Schlaganfall aufgetreten. Wenn das Fräsloch nicht über dem Hub zentriert ist, bohren Sie erneut, um es zu zentrieren.
4. Richten Sie die Einspritzpumpe über die Maus aus und arretieren Sie sie im 90°-Winkel. Reinigen Sie die Spritze mit steriler Kochsalzlösung oder PBS-Lösung, bevor Sie das Material zurückladen.
   1. Sobald die Glasspritze sauber ist, zerlege sie, so dass keine Nadel mehr vorhanden ist. Laden Sie die Spritze mit einer 25-μl-Verdrängerpipette mit 10 μl Hydrogel (oder anderem Biomaterial, hier mit oder ohne Zellen) zurück.
   2. Schieben Sie das Gel mit dem Spritzenkolben ganz an die Vorderseite der Spritze. Setzen Sie dann die Spritze wieder zusammen und drücken Sie weiter, bis das Gel sichtbar aus der Nadel austritt.
5. Setzen Sie die Spritze auf die Pumpe. Die Rückseite der Pumpe muss möglicherweise angepasst werden, damit die Spritze passt. Stellen Sie die Durchflussrate auf 30 μl/min ein, wählen Sie Entnahme oder Injizieren, je nachdem, in welche Richtung er sich bewegen muss, und drücken Sie dann Start. Drücken Sie auf Stopp, wenn sich die Rückseite der Pumpe an der richtigen Stelle befindet.
   1. Schrauben Sie die Rückseite der Pumpe fest, damit die Spritze sicher ist. Wenn zuvor Anpassungen vorgenommen wurden, stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate auf 1 μl/min zurückgesetzt und auf Injektion eingestellt ist.
6. Bewegen Sie die Pumpe in x- und y-Richtung, um sie über dem Loch auszurichten. Bewegen Sie die Pumpe in z-Richtung nach unten, bis die Nadel der Spritze die Oberseite des Lochs berührt.
7. Setzen Sie das Z auf der digitalen Anzeigekonsole zurück. Bewegen Sie dann die Spritze in z-Richtung 0,750 mm nach unten. Wenn sich die Spritze verbiegt oder Widerstand vorhanden ist, ist der Schädel entweder verheilt oder wurde nicht vollständig durchbohrt und muss neu gebohrt werden.
8. Drücken Sie auf der Pumpenkonsole auf Start, um 4 - 6 μl des Hydrogels mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min zu injizieren.
9. Stellen Sie einen 5-Minuten-Timer ein, wenn die Pumpe aufhört zu injizieren, damit das Gel mit der Vernetzung beginnen kann.
10. Ziehen Sie die Spritze nach 5 Minuten langsam nach oben, indem Sie die Z-Noppe drehen. Achten Sie darauf, ob versehentlich Material aus dem Loch gezogen wird oder austritt. Entriegeln Sie die Pumpe und bewegen Sie sie von der Maus weg, wenn die Nadel weit genug vom Schädel entfernt ist.
11. Verschließen Sie die Haut mit einer Pinzette, chirurgischem Kleber oder Nähten über dem Kopf. Setzen Sie die Maus in den sauberen Käfig und beobachten Sie, wie sie sich erholt. Es sollte etwa 5 – 10 Minuten dauern, bis sich die Maus von der Narkose erholt hat.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Bregmas und der Lokalisierung des Schlags. (A) Die Parietallappen treffen sich oben und bilden das Bregma. Die Laserplatzierung wurde 2,0 mm links vom Bregma zentriert. (B

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
25uL Hamilton Spritze 702RN, ohne Nadel	Fishcer Scientific	14824663	Spritzen zur Injektion von Biomaterialien
25uL Direktverdrängerpipette	Gilson	M-25
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
C57BL/6 Mäuse	Jackson Laboratory	664	Alter 8-12 Wochen
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" lang, Durchmesser 6mm, 4er Pack - zum Anbringen von Laser an sterotax
Wattestäbchen	VWR	89031-288
CP 25 Pipettenspitzen	Gilson	F148012
Heizplatte	Kopf Instrumente	HP-4M
IMPAC 6-Integriertes Multi-Patienten-Anästhesiezentrum	VetEquip	901808
Jewlers Pinzette #5	GFS Chemikalien	46085
Miltex Adson Verbandzange, Dissektionsqualität	Intefra Miltex	V96-118
Minipumpe mit variablem Durchfluss	Thomas Scientific	70730-064	Pumpe für Perfusionen
Maus Gas Anästhesie Kopfhalter	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Steuerbox	Chemyx	10050
Nanojet Pumpenkopf	Chemxy	10051	Befestigung an stereotaktische Vorrichtung zur Injektion von Biomaterial
Nadel RN 30G PT STY 3, 0,5 Zoll	Fishcer Scientific	NC9459562
Nicht reißende Ohrstangen 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Salbe	Dr. Foster Smith 9N-76855
Rektalsonde Maus	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Insulinspritze mit 1/2 Einheit Markierung 0,5 mL	VWR	10002-726	Zur Injektion von Rose Bengal
StainTray Objektträger Färbesystem	Simport Scientific	M920-2	Zum Färben von Objektträgern
Sterotaktisches Gerät	Kopf Instruments	940	Stereotaktisches Kleintiergerät
Student Adson-Pinzette -1x2 Zähne	Fine Science Tools	91127-12
Student Feinpinzette - gerade/breit Schäfte	Fine Science Tools	91113-10
Temperaturregler	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT Compound	VWR	25608-930
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnologie	sc-361931