Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Zusammenfassung

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Zusammenfassung

Isolation und Expansion der vermeintlichen neuralen Stammzellen (NSCs) aus der erwachsenen Mäuse-Gehirn wurde zuerst von Reynolds und Weiss im Jahr 1992 beschrieben unter Verwendung eines chemisch definierten serumfreien System als Neurosphäre Assay (NSA) bekannt. In diesem Test, sterben die meisten differenzierte Zelltypen innerhalb weniger Tage der Kultur, sondern eine kleine Population von Wachstumsfaktor reagieren Vorläuferzellen unterziehen aktive Proliferation in Anwesenheit des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und / basic Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Diese Zellen bilden Kolonien von undifferenzierten Zellen, die sogenannten Neurosphären, was wiederum subkultiviert, um den Pool der neuralen Stammzellen erweitern können. Darüber hinaus können die Zellen induziert, um zu unterscheiden, die Erzeugung der drei großen Zelltypen des ZNS, dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Dieser Test liefert ein wertvolles Werkzeug, um eine konsistente, erneuerbare undifferenzierten ZNS-Vorstufen, die in vitro-Studien und auch für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten versorgen.

Dieses Video zeigt die NSA-Methode zu generieren und zu erweitern NSCs aus der adulten Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung der Gehirn der adulten Maus, Mikro-Dissektion der periventrikulären Region, Gewebe und-kultur in der NSA. Die geernteten Gewebe wird zunächst chemisch verdaut unter Verwendung von Trypsin-EDTA und anschließend mechanisch dissoziiert in NSC Medium auf eine einzelne Zelle Suspension zu erzielen und schließlich in der NSA überzogen. Nach 7-10 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären bereit für Subkultur, die Menge an Zellen für zukünftige Experimente erforderlich zu erreichen.

Protokoll

Teil 1: Grundlagen, bevor Sie fortfahren, um Dissektion gesetzt:

1. Entsprechende Volumen von kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet. NSC Medium kann auch im Labor basierend auf NSC Wachstumsmedium Zusammensetzung in der Literatur veröffentlichten gemacht werden ¹. Wenn Ihr Labor nicht viel Erfahrung mit der Herstellung Medium, empfehlen wir dringend, im Handel erhältlichen Mittel, die Qualität für NSCs Wachstum vor gesteuert werden, um verkauft werden (das ist der Fall für NeuroCult, Stem Cell Technolgies) verfügt.
2. Das M....

Diskussion

Die Neurosphäre Test ² hat große Aufmerksamkeit in der Forschung nicht nur für die Isolierung und Untersuchung der NSCs aus CNS ^4-5, sondern auch für die Isolierung von anderen Arten von vermeintlichen Stammzellen aus zahlreichen Geweben, wie ^Brust-6 und Herz ⁷ gewonnen und für die Identifizierung von Gehirn-, Brust-und Darmkrebs Tumorstammzellen ^8-9 darauf hindeutet, dass diese Kultur-System eine Reihe von somatischen und Tumor-Vorläuferzellen Zellpopulationen im g.......

Materialien

* Um HEM machen, mischen 110L Paket MEM and160ml 1M HEPES und bringen das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Setzen Sie den End-pH auf 7,4 und speichern Sie sie bei 4 ° C.