Konstruktion einer kompositorischen regenerativen peripheren Nervenschnittstelle in einem Rattenmodell für Nervenverletzungen

Abstract

Quelle: Svientek, S. R., et al. Herstellung der kompositorischen regenerativen peripheren Nervenschnittstelle (C-RPNI) bei der erwachsenen Ratte. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die chirurgische Konstruktion einer kompositiven regenerativen peripheren Nervenschnittstelle (C-RPNI) in einem Rattenmodell für periphere Nervenverletzungen. Bei dem Verfahren wird ein durchtrennter Peroneusnerv an ein Muskeltransplantat gebunden und mit einem dermalen Hauttransplantat überlagert, um die Nervenregeneration zu fördern. Im Laufe der Zeit stellen motorische und sensorische Neuronen Verbindungen innerhalb der Transplantate wieder her und ermöglichen die Bildung funktioneller neuromuskulärer und sensorischer Strukturen.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

HINWEIS: Spenderratten haben vor Haut- und Muskelspenden freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Euthanasie wird unter tiefer Narkose durchgeführt, gefolgt von einer intrakardialen Kaliumchlorid-Injektion mit einer sekundären Methode des bilateralen Pneumothorax. Theoretisch kann jeder Rattenstamm mit diesem Experiment verwendet werden; Unser Labor hat jedoch sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Fischer F344-Ratten (~200-250 g) im Alter von zwei bis vier Monaten konsistente Ergebnisse erzielt. Spenderratten müssen isogen zu den Versuchsratten sein.

1. Vorbereitung des Hauttransplantats:

1. Anästhesieren Sie die Spenderratte in einer Induktionskammer mit einer Lösung von 5% Isofluran in Sauerstoff bei 0,8-1 l/min. Sobald die Ratte betäubt wurde, nehmen Sie sie aus der Induktionskammer und legen Sie sie auf einen Nasenkonus mit Rückatmung, wobei Sie das Isofluran auf 2-2,5% senken, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
2. Verabreichen Sie eine Lösung von 0,02-0,03 ml Carprofen (50 mg / ml) in 0,2 ml steriler Kochsalzlösung subkutan zwischen den Schulterblättern zur Analgesie.
3. Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf beide Augen auf, um Hornhautgeschwüren vorzubeugen.
4. Rasieren Sie mit einer Schermaschine die gesamten unteren Hintergliedmaßen, die Knöchelregion und die Seiten der Pfote(n).
5. Reinigen Sie die ausgewählte Hintergliedmaße und die Plantaroberfläche der Pfote mit Alkohol, gefolgt von einer Jodopovidonlösung, die mit einer abschließenden Reinigung mit Alkohol endet, um das restliche Jodopovidon zu entfernen.
6. Mit einem tragbaren Mikromotor-Hochgeschwindigkeitsbohrer und einem abnehmbaren runden Polierstein mit feiner Körnung (4000 U/min) die Plantaroberfläche der Pfote entgraten, um die Epidermis zu entfernen. Tragen Sie während des Entgratens Tropfen Kochsalzlösung auf, um die Haut nicht zu verbrennen. Die darunterliegende Dermis erhält ein glänzendes Aussehen mit punktuellen Blutungen.
7. Legen Sie ein Tourniquet auf die untere Extremität, um den Blutfluss zu verlangsamen.
8. Entfernen Sie die Plantarhaut scharf mit einem Skalpell #15 und legen Sie sie in eine mit Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze, um ein Austrocknen zu verhindern. In diesem Schritt wird ein Teil des Sehnen- und Bindegewebes von Natur aus mit der Haut entfernt und später entfernt.
9. Tragen Sie einen Mullwickel auf den blutenden Fuß auf, um die Blutung zu verlangsamen. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.9, wenn Sie zwei Konstrukte erstellen.
10. Entfernen Sie unter einem Mikroskop (20-fache Vergrößerung) mit einer Mikroschere das Sehnen- und Bindegewebe aus der tiefen Schicht des Hauttransplantats. Achten Sie darauf, keine Löcher in das Transplantat zu machen. Das verdünnte Hauttransplantat sollte leicht undurchsichtig sein und nur die Dermis enthalten und eine Größe von ca. 0,5 cm x 1,0 cm haben.
11. In mit Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze legen, bis sie für die Herstellung des C-RPNI-Konstrukts bereit ist. Die Transplantate sollten innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme verwendet werden.

2. Vorbereitung des Muskeltransplantats

:

1. Machen Sie mit einem Skalpell #15 einen Längsschnitt entlang der vorderen Seite der unteren Hintergliedmaße von knapp über dem Knöchel bis knapp unter das Knie. Präparieren Sie durch das Unterhautgewebe, um die darunter liegende Muskulatur freizulegen.
2. An der distalen Seite des Schnittes legen Sie die sehnenartigen Ansätze der Muskulatur der unteren Extremität frei. Der Tibialis anterior (TA) ist in der Regel der größte und vorderste Muskel, und direkt unter und hinter diesem Muskel liegt der Extensor digitorum longus (EDL). Isolieren Sie die distale EDL-Sehne von den anderen Sehnen in diesem Bereich und achten Sie darauf, dass der Ansatz an dieser Stelle nicht eingeschnitten wird.
3. Stellen Sie sicher, dass die richtige Sehne isoliert ist, indem Sie beide Zinken einer Pinzette unter die Sehne einführen und durch Öffnen der Pinzette Druck nach oben ausüben, um eine Sehnenauslenkung zu verursachen. Die Manipulation dieser Sehne sollte dazu führen, dass sich alle Zehen gleichzeitig strecken.
4. Führen Sie eine distale Tenotomie mit einer scharfen Irisschere durch und trennen Sie den Muskel stumpf mit Tenotomien (oder einer anderen stumpfen Schere) vom umgebenden Gewebe, wobei Sie proximal arbeiten, um den sehnenartigen Ursprung zu finden.
5. Sobald die proximale Sehne sichtbar ist, führen Sie erneut eine Tenotomie mit einer scharfen Irisschere durch. Legen Sie das Muskeltransplantat in eine mit Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze, um ein Austrocknen zu verhindern.
6. Sobald alle gewünschten Transplantate von einer Spenderratte entnommen wurden, euthanasieren Sie hauptsächlich durch intrakardiale KCl-Injektion (1-2 mEq K+/kg), gefolgt von einer sekundären Euthanasie mit beidseitigem Punktionspneumothorax mit einer #15-Klinge.

3. Isolierung und Vorbereitung des Nervus peroneus communis

1. : Anästhesieren und Analgesie der Versuchsratte gemäß dem in den Schritten 1.1-1.3 beschriebenen Protokoll durchführen.
2. Rasieren Sie den gewünschten Oberschenkel und reinigen Sie ihn mit Alkohol, Betadin und enden Sie mit Alkohol, um Spuren von Betadin zu entfernen.
3. Bringen Sie das Tier vom Operationstisch auf den Operationsmikroskoptisch und legen Sie es auf ein Heizkissen mit einem Temperaturfühler zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur. Halten Sie Isofluran bei 2-2,5 % und Sauerstoff bei 0,8-1 l/min.
4. Markieren Sie den Schnitt, der sich von distal über die Ischiaskerbe bis zum unteren Teil des Knies erstreckt. Diese Markierung sollte unterlegen und von ihm weg abgewinkelt sein. Machen Sie den Schnitt mit einer Klinge #15 und schneiden Sie durch die darunter liegende Faszie des Bizeps femoris.
5. Präparieren Sie vorsichtig mit einem Blutstiller oder einer stumpfen Mikroschere durch den Musculus biceps femoris bis zu dem Raum unter dem Bizeps femoris.
   HINWEIS: Der Ischiasnerv verläuft ungefähr in die gleiche Richtung wie der ursprüngliche Schnitt, der gemacht wurde. Es gibt drei Äste, typischerweise mit dem Nervus suralis posterior und dem Nervus peroneus communis und dem Nervus tibialis, die oberflächlich bzw. tief zum Knie verlaufen.
6. Nach der Identifizierung des Nervus peroneus communis (CP) wird mit einer Mikrozange mit feiner Spitze und einer Mikroschere der Nervus CP vorsichtig von den anderen Ischiasästen isoliert und das verbleibende Bindegewebe distal entfernt.
7. An der Stelle, an der der Nerv die Oberfläche des Knies kreuzt, den Nerv mit einer Mikroschere scharf durchschneiden.
   HINWEIS: Die Verwendung einer scharfen Schere ist in diesem Schritt äußerst wichtig, da eine schwere Traumatisierung des Nervs das Risiko der Neurombildung erhöhen kann.
8. Befreien Sie vorsichtig das restliche Bindegewebe vom CP-Nerv und arbeiten Sie proximal, um den Nerv auf eine Länge von ca. 2 cm zu befreien.

4. Herstellung des C-RPNI-Konstrukts

:

1. Entfernen Sie das Muskeltransplantat aus der mit Kochsalzlösung befeuchteten Gaze und entfernen Sie das gesamte zentrale Sehnengewebe sowie ein kleines zentrales Segment des Epimysiums. Lassen Sie die sehnenförmigen Enden intakt.
2. Mit einem 8-0 Nylonnaht, befestigen Sie das Epineurium des durchtrennten Endes des CP-Nervs mit zwei unterbrochenen Nähten auf beiden Seiten des Nervs an dem Bereich des Muskeltransplantats ohne Epimysium.
3. Befestigen Sie das Muskeltransplantat am Oberschenkelperiost mit einem einzigen unterbrochenen 6-0-Nylonstich sowohl proximal als auch distal, wobei die Nerven-Muskel-Verbindung vom Oberschenkelknochen weg zeigt.
   HINWEIS: Sichern Sie den Muskel so, dass er sich in normaler, entspannter Länge befindet. Versuchen Sie, den Muskel nicht signifikant zu dehnen oder zu viel Nachlässigkeit beim Sichern zu lassen.
4. Platzieren Sie einen 8-0 Nylonstich am unteren, zentralen Rand des Muskeltransplantat-Epimysiums, das so am CP-Nervenepineurium befestigt wird, dass der Nerv innerhalb des Muskeltransplantats schlaff wird und dazu beiträgt, zukünftige Spannungen zu lösen, denen es bei späterer Gehfähigkeit ausgesetzt sein könnte.
5. Entnehmen Sie das Hauttransplantat aus der mit Kochsalzlösung befeuchteten Gaze und ordnen Sie es so auf dem Muskeltransplantat an, dass es den Nerv und den größten Teil des Muskels vollständig bedeckt. Stellen Sie sicher, dass der tiefe Rand der Dermis auf dem Muskel aufliegt. Trimmen Sie jede Dermis, die über die Grenze des Muskels hinausragt.
6. Befestigen Sie das Hauttransplantat umlaufend mit 8-0 am Muskeltransplantat Nylon unterbrochene Nähte. In der Regel werden je nach Größe des Konstrukts insgesamt 4-8 Nähte verwendet.
7. Schließen Sie die Faszie des Bizeps femoris über dem Konstrukt laufend mit einer 5-0 chromischen Naht.
8. Verschließen Sie die darüber liegende Haut mit einer 4-0 Chrom-Naht in Laufmanier.
9. Tupfen Sie den Operationsbereich mit einem Alkoholtupfer ab und tragen Sie eine antibiotische Salbe auf.
10. Beenden Sie die Inhalationsanästhesie und lassen Sie die Ratte sich mit Futter- und Wasserquellen erholen, die von den Käfiggenossen getrennt sind.

Materials