Photoabbaubare Hydrogel-basierte Isolierung von Bakterienkolonien in Mikrotiter-Arrays

Zusammenfassung

Quelle: Fattahi, N., et al. Photoabbaubare Hydrogel-Grenzflächen für das Screening, die Selektion und die Isolierung von Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienkolonien in Silizium-Mikrotiter-Arrays. Bakterienzellen werden zunächst in Mikrovertiefungen geladen, in ein vernetztes Hydrogel eingekapselt und in unterschiedlichen Kolonien kultiviert. Bei Einwirkung von ultraviolettem Licht ermöglicht der gezielte Abbau des Hydrogels die selektive Extraktion einzelner Kolonien.

Protokoll

1. Bakterienstämme und Kulturprotokolle

1. Streifen von Bakterienkolonien auf Agarplatten, die mit geeigneten Wachstumsmedien ergänzt werden. In diesem Bericht wird Bacillus subtilis (Stamm 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) auf ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM Glukose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/l Agar) Agarplatten, ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin und Escherichia coli (Stamm 25922, ATCC) auf ATGN-Agarplatten, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
   HINWEIS: Frühere Berichte über die Verkapselung und Freisetzung von Hydrogelen mit diesen Materialien verwendeten stattdessen A. tumefaciens C58-Zellen
2. . Entnehmen Sie die gewünschten Kolonien von ATGN-Agarplatten und beginnen Sie mit Kulturen über Nacht. Für die hier verwendeten E. coli- und B. subtilis-Stämme bei 37 °C und Schütteln bei 215 U/min in ATGN-Flüssigmedium für 24 h kultivieren. Lagern Sie die Zellkulturen in 50% Glycerin bei -80 °C bis zur zukünftigen Verwendung.
3. Kolonien beider Stämme werden mit sterilen Impfösen aus Glycerinbeständen entnommen und 24 Stunden lang bei 37 °C und 215 U/min in ATGN-Flüssigmedien inkubiert.

2. Vorbereitung des für die Hydrogelbildung benötigten Materials

1. Photoabbaubares Poly(ethylenglykol)-o-nitrobenzyldiacrylat (PEG-o-NB-diacrylat)-Synthese
   HINWEIS: Die hauseigene Synthese des PEG-o-NB-Diacrylats wurde gut beschrieben und bereits berichtet. Da es sich bei der Synthese um eine Routine handelt, kann sie auch aus einer chemischen Syntheseanlage ausgelagert werden.
2. Vernetzungspuffer
   1. Nehmen Sie das Rezept des ausgewählten Mediums für den Bakterienstamm und bereiten Sie das Medium mit 2x Nährstoffen vor. Phosphat, z. B. NaH₂PO_4, wird dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben. Stellen Sie dann den pH-Wert mit 5 M NaOH (aq) auf 8 ein.
   2. Die Pufferlösung sterilisieren und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Lassen Sie alle im Medium vorhandenen Übergangsmetalle weg, da diese Metalle die Oxidation der Thiole zu Disulfiden katalysieren.
3. PEG-o-NB-Diacrylat-Lösung
   1. Für jedes mg des aliquoten PEG-o-NB-diacrylat-Pulvers (3.400 Da Molekulargewicht) fügen Sie 3,08 μl Reinstwasser hinzu, um eine Konzentration von 49 mM PEG-o-NB-diacrylat (98 mM Acrylatkonzentration) zu erreichen.
   2. Reiben Sie die Lösung, bis sie gut vermischt ist, und lagern Sie diese Lösung bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
4. 4-armige PEG-Thiol-Lösung
   1. Für die Herstellung von 4-armigem PEG-Thiol (10.000 Da Molekulargewicht) fügen Sie 4 μl Reinstwasser pro mg Pulver hinzu, um eine Konzentration von 20 mM (80 mM Thiolkonzentration) zu erreichen.
   2. Wirbeln Sie diese Lösung auf, bis sie gut vermischt ist, und lagern Sie diese Lösung bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.

5. Herstellung von Silizium-Mikrotiter-Arrays

1. Parylene-Beschichtung: Verwenden Sie das in früheren Forschungsartikeln beschriebene Standardprotokoll, um Siliziumwafer mit Parylene zu beschichten.
2. Mikrofabrikation: Befolgen Sie das in der Literatur beschriebene Protokoll, um das Mikrotiter-Array zu entwerfen und herzustellen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Zur Herstellung von Mikrotiter-Arrays auf Parylene-beschichteten Siliziumwafern wurden photolithographische Standardtechniken angewendet.

7. Hydrogelbildung über Mikrotiter-Arrays

1. Bakterienaussaat in Mikrotiter-Arrays
   HINWEIS: 700 μl von 0,1 OD₆₀₀ (optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm) Zellsuspensionen wurden über die Mikrotiter-Array-Substrate ausgesät, und die Parylene-Lift-off-Methode wurde angewendet, um Zellen aus dem Hintergrund zu entfernen.
2. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung vor, indem Sie 5,6 μl des PEG-o-NB-Diacrylats mit 12,5 μl pH-8-phosphatgepufferter Kochsalzlösung ATGN hinzufügen und mit 6,9 μl der vierarmigen PEG-Thiollösung mischen.
3. 12,5 μl der Vorläuferlösung werden auf einen nicht reaktiven, perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert und zwei 38 μm Stahlabstandshalter (siehe Materialtabelle) auf zwei gegenüberliegende Seiten des mit Zellen inokulierten Mikrotiterplattensubstrats platziert.
4. Den perfluoralkylierten Glasobjektträger mit dem Tröpfchen der Vorläuferlösung invertieren und das Tröpfchen in der Mitte des Mikrotitersubstrats platzieren. Dann 25 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, um das Hydrogel zu bilden.
5. Entfernen Sie den Objektträger vorsichtig vom Mikrotitersubstrat. Die Hydrogelmembran sollte mit dem Mikrotitersubstrat verbunden bleiben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Design und Herstellung von Mikrotiter-Arrays. (A) Standard-Mikrofabrikationstechniken wurden angewendet, um Mikrotiter-Arrays auf Silizium-Wafer. (B) Jedes Substrat bestand aus 7 x 7 Arrays mit ...

Materialien