Trennung von inneren und äußeren Membranfraktionen von gramnegativen Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Cian, M. B. et. al., Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Trennung der inneren und äußeren Membranfraktionen von gramnegativen Bakterien mittels Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation. Die Membranfraktionen werden gereinigt und bei niedrigen Temperaturen gelagert, um membranspezifische Komponenten gezielt zu analysieren.

Protokoll

1. Allgemeine Reagenzien und Medien Vorbereitung für die Membranextraktion

1. Bakterielle Wachstumsmedien: Bereiten Sie 1 l Brühemedium vor und sterilisieren Sie es in einem gründlich gereinigten und autoklavierten 2-Liter-Kolben.
2. Allgemeiner Resuspensionspuffer (1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (Tris-Puffer) pH 7,5; 50 mL): 6,05 g Tris-Base in 30 ml H₂O lösen. pH-Wert mit 5 M HCl auf 7,5 einstellen. Endvolumen mit ultrareinem H₂O auf 50 ml einstellen.
3. Hauptbestand an zweiwertiger Kationen-Chelatlösung (0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA pH 8; 100 ml): 18,6 g Dinatriumethylentetraacetat·2H₂O auf 80 ml H₂O zugeben. Kräftig umrühren und den pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) auf 8,0 einstellen. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 mL mit ultrareinem H₂O.
   HINWEIS ein: Das Dinatriumsalz von EDTA löst sich erst auf, wenn der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von NaOH auf ~8,0 eingestellt wird.
4. Osmotischer Puffer A (0,5 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 1 L): Wiegen Sie 171,15 g Saccharose und geben Sie sie in einen 1 L Zylinder. Fügen Sie 10 ml 1 M Tris pH 7,5 hinzu. Auf ein Endvolumen von 1 l mit hochreinem H₂°C einstellen. Bei 4 °C lagern.
5. Lysozym (10 mg/ml; 5 ml): 50 mg (Hühnereiweiß) Lysozym abwiegen und in 5 ml ultrareinem H₂O auflösen. Bei 4 °C lagern.
6. Verdünnte zweiwertige Kationen-Chelatlösung (1,5 mM EDTA; 500 mL): 1,5 ml 0,5 M EDTA (Schritt 1.3) zu 497,5 ml ultrareines H₂O geben. Bei 4 °C lagern.
7. Osmotischer Puffer B (0,2 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): Wiegen Sie 136,8 g Saccharose und geben Sie sie in einen 2 L Zylinder. Fügen Sie 20 mL von 1 M Tris pH 7,5 hinzu. Das Endvolumen mit hochreinem H₂O auf 2 l einstellen. Bei 4 °C lagern.
8. Nuklease-Co-Faktor (1 M Magnesiumchlorid, MgCl₂; 10 mL): 2,03 g MgCl_{2,6H 2}O in 8 mL hochreines H₂O lösen. Das Volumen auf 10 mL einstellen. Bei Raumtemperatur lagern.
9. Nukleaselösungscocktail mit RNase- und DNase-Enzymen: Siehe Materialtabelle. Bei -20 °C lagern.
10. Proteasehemmer-Cocktail: Siehe Materialtabelle. Bei 4 °C lagern.
11. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte (20 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung; 100 mL): Wiegen Sie 20 g Saccharose und geben Sie sie in einen 200 mL Zylinder. Fügen Sie 100 μl 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μl 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Das Endvolumen auf 100 mL mit hochreinem H₂O einstellen. Bei Raumtemperatur lagern.
12. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung mittlerer Dichte (53 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung; 100 mL): 53 g Saccharose wiegen und in einen 200 mL Messzylinder umfüllen. Fügen Sie 100 μl 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μl 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 mL mit hochreinem H₂O ein. Bei Raumtemperatur lagern.
    HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung in einem Messzylinder vor, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Anteils an Saccharose zu gewährleisten. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu und rühren Sie, bis sich die Saccharose vollständig in der Lösung aufgelöst hat. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.
13. Isopyknische Saccharose-Gradientenlösung mit hoher Dichte (73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 Lösung; 100 mL): Wiegen Sie 73 g Saccharose und geben Sie sie in einen 200 mL Messzylinder. Fügen Sie 100 μl 1 M Tris-Puffer pH 7,5 und 200 μl 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 mL mit ultrareinem H₂O ein. Bei Raumtemperatur lagern.
    HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung in einem Messzylinder vor, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Anteils an Saccharose zu gewährleisten. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu und rühren Sie, bis sich die Saccharose vollständig aufgelöst hat. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.
14. Isolierter Membran-Lagerpuffer (10 mM Tris-Puffer pH 7,5; 1 L): Geben Sie 1 mL 1 M Tris-Puffer pH 7,5 in einen 1-l-Kolben und stellen Sie das Endvolumen auf 1 l mit hochreinem H₂O ein.

2. Vorbereitung der Bakterien für die Membranextraktion

1. Streichen Sie die Bakterien aus gefrorenen Glycerinbrühen auf frische Agarplatten. Lagern Sie die Platten bei 4 °C, sobald sich die Bienenvölker bilden. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in ein mit Bouillon gefülltes 5-ml-Röhrchen und kultivieren Sie die Bakterien wie gewünscht über Nacht.
2. Verdünnen Sie die Bakterienkultur über Nacht in 1 l bevorzugtes Bouillonmedium zurück und kultivieren Sie die Bakterien, bis die gewünschte optische Dichte erreicht ist.
   HINWEIS: Die Inokulation einer einzelnen Bakterienkolonie in 1 l Bouillonmedium wird für mutierte Genotypen empfohlen, die dazu neigen, Wachstumsphänotypen zu unterdrücken, aber einige gramnegative Bakterien wachsen einfach langsamer als andere. Wenn es nicht möglich ist, eine ausreichende Kulturdichte durch Inokulation in einer einzigen Kolonie zu erreichen, ist die Rückverdünnung einer Kultur über Nacht in 1 l Medium eine Strategie, um das Wachstum zu synchronisieren. Die Zusammensetzung der Bakterienmembran variiert je nach Wachstumsphase der Kultur (logarithmische vs. stationäre Phase). Wachstumskurven, die die Änderung der optischen Dichte für die Bakterienkulturen in Abhängigkeit von der Zeit messen, sollten mit allen Stämmen durchgeführt werden, um die Kulturdichte mit der Wachstumsphase zu korrelieren.
3. Die Kolben mit den Brühekulturen auf Eis legen. Lesen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) ab und berechnen Sie das Kulturvolumen, das zwischen 6,0 und 8,0 x^{10 11} bakteriellen koloniebildenden Einheiten (KBE) entspricht. Für S. Typhimurium entspricht dies 1 L Kultur bei einem OD₆₀₀ zwischen 0,6 und 0,8, da ein OD600 von 1,0 etwa 1,0x10⁹ KBE/ml entspricht. Geben Sie dieses Volumen in ein Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass die restlichen Kulturen bis zur Verwendung auf Eis bleiben.
4. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 4 °C bei 7.000-10.000 x g in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit festem Winkel für 10 min.
   HINWEIS: Kühlen Sie die Zentrifugen vor und halten Sie sie auf niedriger Temperatur. Bewahren Sie die Proben während des gesamten Verfahrens auf Eis auf.
5. Dekantieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn vorsichtig.
   HINWEIS: Wenn die Membranfraktionen nicht sofort extrahiert werden, kann das Pellet schockgefroren und/oder bei -80 °C gelagert werden. Es wird jedoch empfohlen, die Plasmolyse direkt am selben Tag durchzuführen, an dem die Zellen entnommen werden, insbesondere bei nicht-enterobakteriellen Spezies.

3. Dissoziation der äußeren Membran und Plasmolyse

Tauen

1. Sie die Zellpellets auf Eis auf, wenn sie zuvor bei -80 °C gelagert wurden, und bewahren Sie die Proben für den Rest des Verfahrens auf Eis auf. Jedes Zellpellet im Zentrifugenröhrchen in 12,5 ml Puffer A resuspendieren. Fügen Sie der Suspension der Zellen einen magnetischen Rührstab hinzu.
2. Fügen Sie 180 μl 10 mg/ml Lysozym (Endkonzentration von 144 μg/ml) zu jeder Zellresuspension hinzu. Halten Sie die Proben unter Rühren 2 Minuten lang auf Eis.
3. Geben Sie 12,5 mL 1,5 mM EDTA-Lösung zu jeder Zellresuspension und rühren Sie weitere 7 Minuten auf Eis weiter.
4. Die Suspension wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 9.000-11.000 x g zentrifugiert.
5. Überstände in einen Behälter für biologisch gefährliche Abfälle geben und die Pellets auf Eis halten.
6. Geben Sie 25 ml Puffer B zum Zellpellet
.
7. Geben Sie 55 μl 1 M MgCl₂, 1 μl RNase/DNase-Nuklease-Reagenz (zur Vermeidung von Viskositätsproblemen im Zusammenhang mit Bakterien, die sich vor der Homogenisierung einer Plasmolyse unterziehen) und 1 μl Proteaseinhibitor-Cocktail zum Volumen von Puffer B, das auf dem Zellpellet sitzt
8. . Pipettieren Sie kräftig und wirbeln Sie vor, bis Sie eine homogene Lösung erhalten.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, eine homogene Lösung zu haben, bevor Sie mit Schritt 4 dieses Protokolls fortfahren. Die resuspendierten Zellen sollten ein zähflüssiges, kuchenteigartiges Aussehen und eine ähnliche Konsistenz haben.
9. Jede Probe 15 s lang vortexen. Die Suspensionen auf Eis aufbewahren und mit Schritt 4 fortfahren.

4. Druckbeaufschlagte Homogenisierung und Lyse
HINWEIS: Für die Lyse können verschiedene Methoden verwendet werden. Die Beschallung ist aufgrund der Wärmeerzeugung nicht ideal. Eine osmotische Lyse kann erreicht werden, ist aber oft ineffizient. Daher empfehlen wir die Hochdrucklyse. Die Hochdrucklyse kann mit einer Vielzahl von Instrumenten erreicht werden. Wir empfehlen Homogenisierungsmaschinen wie die French Press oder die Emusliflex. Wir arbeiten mit vielen Arten von gramnegativen Bakterien, die unterschiedlich auf hochosmolare Saccharoselösungen reagieren. Der Hochdruck-Homogenisierungsschritt verbessert die Effizienz, Reproduzierbarkeit und Ausbeute.

1. Kühlen Sie die French-Press-Zelle bei 4 °C vor oder legen Sie die Metallspule aus der Homogenisatormaschine auf Eis.
2. Gießen Sie die Probe in die französische Druckzelle oder den Homogenisator-Probenzylinder und bringen Sie die Zelle auf den gewünschten Homogenisierungsdruck (10.000 psi sollten bei Verwendung einer French Press oder 20.000 psi bei Verwendung eines Homogenisators ausreichend sein).
3. Stellen Sie die Auslassdurchflussrate auf etwa einen Tropfen pro Sekunde ein, während Sie den Druck beibehalten, wenn Sie eine French Press verwenden.
4. Sammeln Sie das Zelllysat in konischen 50-ml-Röhrchen, während Sie die Proben auf Eis aufbewahren.
5. Die Schritte 4.2 bis 4.4 werden drei- bis fünfmal wiederholt, um eine vollständige Lyse zu erreichen, die sich in der Regel durch eine allmähliche Erhöhung der Transparenz der Probe bemerkbar macht.
   HINWEIS: Die Probenkammer sollte zwischen den Proben gewaschen und mit Puffer B äquilibriert werden.
6. Bewahren Sie lysierte Zellen auf Eis auf.

5. Totale Membranfraktionierung

1. : Zentrifugieren Sie die lysierten Bakterienproben bei 6.169 x g für 10 min bei 4 °C, um das verbleibende intakte Zellmaterial zu pelletieren. (z. B. unlysierte Bakterienzellen).
2. Den restlichen Teil des Überstands, der nun die homogenisierten Membranen enthält, zur Ultrazentrifugation in eine Polycarbonatflasche verteilen.
   ACHTUNG: Bei Bedarf können Zellproben durch Verdünnen mit Puffer B ausgeglichen werden.
3. Ultrazentrifugieren Sie die Zelle bei 184.500 x g für mindestens 1 h bei 4 °C. Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, ohne die Qualität der Membranen zu beeinträchtigen.
4. Entsorgen Sie den restlichen Überstand im Ultrazentrifugenröhrchen und halten Sie die Membranpellets auf Eis (Abbildung 1).
5. Die Membranpellets werden mit einem Glas-Dounce-Homogenisator in 1 ml der isopyknischen Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte resuspendiert. Das Probenhomogenat mit einer Pasteur-Glaspipette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis aufbewahren.
   HINWEIS: Wenn nur eine Analyse der Gesamtmembranzusammensetzung gewünscht wird, ersetzen Sie 1 ml isolierten Membranspeicherpuffer durch 1 ml isopyknische Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte. Schritt 5.5 ist der Endpunkt der Isolierung, wenn nur die Gesamtzahl der bakteriellen Membranproben gewünscht wird. Lagern Sie die Proben bei -20 °C, bis eine weitere nachgelagerte Analyse erforderlich ist.

6. Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Trennung der Doppelmembranen

1. Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von 13 mL Polypropylen oder ultraklaren Röhrchen mit offenem Oberkörper, die für einen schwingenden Schaufelrotor und eine Ultrazentrifuge spezifiziert sind.
2. Halten Sie das Röhrchen in einer leicht geneigten Position und bereiten Sie den Saccharosegradienten vor, indem Sie langsam Saccharoselösungen von höherer Dichte zu niedrigerer Dichte in der folgenden Reihenfolge hinzufügen:2 mL mit 73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 mL mit 53 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   1. Weiter, Die gesamte Membranfraktion (1 ml) wird zugegeben, die in der 20%igen W/V-Saccharoselösung resuspendiert wurde (Schritt 5.5). Vermeiden Sie es, die Membranfraktion mit der darunter liegenden Saccharoselösung zu vermischen. Zwischen jeder dieser Schichten sollten Unterteilungen sichtbar sein.
   2. Füllen Sie abschließend das Röhrchen mit der isopyknischen Saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte (ca. 6 mL). Polypropylen und ultraklare Röhrchen mit offenem Oberteil sollten so voll wie möglich gefüllt werden (2 oder 3 mm von der Röhrchenoberseite entfernt), um die Röhrchen zu stützen.
3. Anpassung an Acinetobacter baumannii 17978
   1. Passen Sie einen angepassten Saccharose-Gradienten für die Verwendung mit verschiedenen Bakterienproben an. Für A. baumannii ermöglichte der folgende Saccharosegradient eine vollständigere Trennung der Membranen (Abbildung 2): 2 mL 73 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 mL 45 % w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   2. Als nächstes wird die gesamte Membranfraktion (1 mL) hinzugefügt, die in der 20 % igen Saccharoselösung resuspendiert wurde (Schritt 5.5). Vermeiden Sie es, die Membranfraktion mit der darunter liegenden Saccharoselösung zu vermischen. Zwischen jeder dieser Schichten sollten Unterteilungen sichtbar sein.
   3. Füllen Sie schließlich das Röhrchen mit isopyknisch-saccharose-Gradientenlösung niedriger Dichte (ca. 6 mL). Polypropylen und ultraklare Röhrchen mit offenem Oberteil sollten so voll wie möglich gefüllt werden (2 oder 3 mm von der Röhrchenoberseite entfernt), um die Röhrchen zu stützen.
4. Ultrazentrifugieren Sie die Proben mit einem Ausschwingrotor bei 288.000 x g und 4 °C über Nacht.
   HINWEIS: Für die in den vorangegangenen Schritten verwendeten Volumina empfehlen wir Zentrifugationszeiten zwischen 16 h und 23 h.
5. Schneiden Sie das Ende einer P1000-Pipettenspitze etwa 5 mm von der Spitze entfernt ab. Entfernen Sie mit der Pipette die obere braune innere Membranschicht (IM). Die IM-Fraktion wird zur Ultrazentrifugation in eine Polycarbonatflasche überführt.
6. Lassen Sie etwa 2 ml der Saccharoselösung über der 53-73%igen Grenzfläche, um sicherzustellen, dass die untere weiße Außenmembran (OM) nicht mit der IM-Fraktion kreuzkontaminiert ist. Wiederholen Sie den Pipettiervorgang aus Schritt 6.4 für die OM-Fraktion (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Membranen können auch entnommen werden, indem Sie die Zentrifugenröhrchen am Boden mit einer Nadel punktieren und als Fraktionen tropfenweise sammeln.
7. Füllen Sie den verbleibenden Hohlraum des Ultrazentrifugenröhrchens mit isoliertem Membranspeicherpuffer und mischen Sie es durch Inversion oder Pipettieren. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
8. Die nun gewaschenen und isolierten Membranen werden durch Ultrazentrifugation bei 184.500 x g für 1 h bei 4 °C gesammelt.
9. Der Überstand wird verworfen und die Membranen werden durch Dounce-Homogenisierung resuspendiert. Fügen Sie 500-1000 μl Lagerpuffer hinzu. Sammeln Sie die Proben in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
10. Lagern Sie die Bakterienmembranproben bei -20 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein Schema, das das in diesem Methodenartikel beschriebene Verfahren zur Isolierung gramnegativer Bakterienmembranen darstellt. Das Verfahren zur Entnahme von Bakterienzellen und zur Isolierung der gesamten, inneren (IM) und äußeren Membran (...

Materialien