Bewertung von Bakterien-Wirtszell-Interaktionen mit biomimetischen Kügelchen

Zusammenfassung

Quelle: Stones, D. H., et al. Biomimetische Materialien zur Charakterisierung von Bakterien-Wirt-Interaktionen. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Verwendung von bakteriomimetischen Kügelchen zur Quantifizierung der bakteriellen Adhäsion an Wirtsepithelzellen unter kompetitiven Bedingungen. Es beschreibt die Schritte bei der Behandlung der Zellen, ihrer Lyse und der Beschichtung von seriellen Verdünnungen zur Messung koloniebildender Einheiten.

Protokoll

1. Messung der bakteriellen Adhäsion
   1. Zu angegebenen Zeitpunkten (z.B. 1 Stunde nach der Infektion) das Medium aus der Zellschicht entfernen.
   2. Waschen Sie die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (mindestens 3-4 Wäschen à 1 ml PBS), um alle nicht anhaftenden Zellen zu entfernen.
   3. Lysieren Sie die Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1 % v/v Triton X-100 Lösung in PBS pro Vertiefung. Die Platte bei 37 °C 5 min inkubieren.
   4. Pipettieren Sie jede Probe mehrmals auf und ab, bevor Sie den Inhalt jeder Vertiefung in separate 1,5-ml-Röhrchen übertragen. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Proben in steriles PBS vor (z. B. verwenden Sie 100 ml Probe und 900 ml PBS).
   5. 100 μl jeder Probe auf marinen Luria-Bertani (MLB)-Agar auftragen und mit einem Zellstreuer verteilen. Optimieren Sie, welche Verdünnungen je nach Bakterienstämmen und Zeitpunkt plattiert werden sollen.
      Hinweis: Für den beschriebenen Versuchsaufbau ergeben 10-^{, 5}- oder 10-6-fache Verdünnungen eine geeignete Anzahl von koloniebildenden Einheiten (KBE).
   6. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C O/N und zählen Sie die Bakterien durch Koloniezählung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Carboxylat-modifizierte Polystyrolkügelchen	Sigma	CLB9	schädlich; eine Reihe alternativer Partikelgrößen und -farben ist verfügbar
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hohe Glukose - Mit 4500 mg/L Glukose und Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, Natriumpyruvat und Phenolrot, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen	Sigma	D1145	für Infektionsexperimente
DMEM	Sigma	D6429	für die Konservierung von kultivierten Wirtszellen
Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviert	Sigma	F9665	Supplement für Gewebekulturmedium
Penicillin-Streptomycin -Lösung stabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen	Sigma	F9665	Supplement für Gewebekulturmedium
PBS	Sigma	D8537
Plasticware
24-Well-Platten	Greiner	662160
Ausstattung
Gewebekulturanlagen
Mehrkanalpipette