Ein Assay zur Quantifizierung von anorganischem Polyphosphat in Bakterien

Zusammenfassung

Quelle:

Protokoll

1. Ernte von Proben für die Polyphosphat-Extraktion

1. Züchten Sie Bakterien unter den Bedingungen, die für die Bestimmung des PolyP-Gehalts von Interesse sind. Für dieses Protokoll züchten Sie Lactobacillus reuteri über Nacht bei 37 °C ohne Schütteln in einem Äpfelenzym-Induktionsmedium (MEI) ohne Cystein (MEI-C).
2. Ernten Sie durch Zentrifugation in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen genügend Zellen, um insgesamt 50 – 100 μg zelluläres Protein zu erhalten (siehe Schritt 3 unten). Für E. coli ist dies 1 ml einer logarithmischen Phasenkultur bei einem A₆₀₀ von 0,2 - 0,4. Für L. reuteri ist dies 1 ml einer Übernachtkultur. Bei Bedarf für andere interessante Arten anpassen.
3. Entfernen Sie den Überstand vollständig von den Zellpellets.
4. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 250 μl GITC-Lysepuffer (4 M Guanidin-Isothiocyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) und lysieren Sie sie durch Inkubation bei 95 °C für 10 min. Lagern Sie die Lysate bei -80 °C.
   HINWEIS: Halten Sie die Lysezeit ein, da eine längere Inkubation bei hohen Temperaturen zu einer Degradation von PolyP durch Hydrolyse führen kann. Lysate können unbegrenzt bei -80 °C gelagert werden.
   ACHTUNG: Guanidin-Isothiocyanat ist ein chaotropes Salz und sollte mit Handschuhen angefasst und als Sondermüll entsorgt werden.

2. Messung des Proteingehalts von Zelllysaten

1. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA)-Standards vor, die 0, 0,1, 0,2 und 0,4 mg ^ml-1 BSA in GITC-Lysepuffer enthalten.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die BSA-Standards in GITC zu erstellen, da GITC die Farbentwicklung des Bradford-Assays beeinflusst. BSA-Standards können unbegrenzt bei -20 °C gelagert werden.
2. Aliquot von 5 μl aufgetauter, gut gemischter Zelllysate und BSA-Standards zur Trennung von Wells in einer durchsichtigen 96-Well-Platte.
3. Geben Sie 195 μl Bradford-Reagenz in jede Vertiefung und messen Sie die Absorption bei 595 nm (A₅₉₅) in einem Plattenleser (siehe Materialtabelle).
4. Berechnen Sie die Proteinmenge in jeder Vertiefung durch Vergleich mit der BSA-Standardkurve unter Verwendung der Formel y = mx + b, wobei y A₅₉₅, x μg BSA, m die Steigung der Standardkurve und b der y-Achsenabschnitt der Standardkurve ist. Multiplizieren Sie den resultierenden Wert mit 0,05, um die Gesamtmenge an Protein in jeder Probe zu bestimmen.

3. Extraktion von Polyphosphat

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1. Geben Sie 250 μl 95%iges Ethanol in jede GITC-lysierte Probe und wirbeln Sie sie zum Mischen auf.
2. Tragen Sie diese Mischung auf eine Siliziumdioxidmembran-Spin-Säule auf und zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 16.100 x g.
3. Verwerfen Sie den Durchfluss, fügen Sie dann 750 μl 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 % Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie 30 s lang bei 16.100 x g.
4. Den Durchfluss verwerfen und 2 min bei 16.100 x g zentrifugieren.
5. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen und fügen Sie 150 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8) hinzu.
6. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann PolyP durch Zentrifugieren für 2 min bei 8.000 x g.
   HINWEIS: Falls gewünscht, können die Eluate mindestens 1 Woche bei -20 °C gelagert werden.

4. Aufschluss von Polyphosphat

1. Bereiten Sie Standards vor, die 0, 5, 50 oder 200 μM Kaliumphosphat in 50 mM Tris-HCl (pH 8) enthalten.
   HINWEIS: Kaliumphosphatstandards können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Aliquotieren Sie 100 μl jedes Phosphatstandards und der extrahierten PolyP-Proben in separate Vertiefungen einer durchsichtigen 96-Well-Platte.
3. Bereiten Sie einen Mastermix vor, der (pro Probe) 30 μl 5x ScPPX-Reaktionspuffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 250 mM Ammoniumacetat, pH 7,5)13, 19 μl H₂O und 1 μl gereinigtes ScPPX (1 mg mL-1) enthält.
4. Geben Sie 50 μl des Mastermixes in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. 15 min bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Falls gewünscht, können die aufgeschlossenen polyP-Proben unbegrenzt bei -20 °C gelagert werden.

5. Nachweis von freiem Phosphat

1. Bereiten Sie die Basis der Nachweislösung vor, indem Sie 0,185 g Antimon-Kaliumtartrat in 200 ml Wasser lösen, 150 ml 4 N H₂SO₄ hinzufügen und dann 1,49 g Ammoniumheptamolybdat hinzufügen. Rühren, um sich aufzulösen, und dann auf ein Endvolumen von 456 ml bringen. Die Lösung filtrieren, um Partikel zu entfernen, und bis zu 1 Monat lichtgeschützt bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M Ascorbinsäure vor. Lichtgeschützt bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
3. Bereiten Sie jeden Tag einen frischen Vorrat an Nachweislösung vor, indem Sie 9,12 ml Nachweislösungsbasis mit 0,88 ml 1 M Ascorbinsäure mischen. Lassen Sie die Detektionslösung vor der Verwendung auf Raumtemperatur kommen.
4. Geben Sie 50 μl Detektionslösung zu jeder Probe und jedem Standard in der 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie etwa 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Farbentwicklung zu ermöglichen.
5. Messen Sie die Extinktion bei 882 nm mit einem Plattenlesegerät und berechnen Sie die Phosphatkonzentration jeder Probe im Vergleich zur Kaliumphosphat-Standardkurve.
   ACHTUNG: Die Nachweislösung enthält giftige Salze und starke Säuren. Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie überschüssige Lösung als Giftmüll.

6. Berechnung des zellulären Polyphosphatgehalts

1. Rechnen Sie die in Schritt 5.5 ermittelten Phosphatkonzentrationen in Nanomol von polyP-abgeleitetem Phosphat in jedem gesamten Zelllysat nach folgender Formel um:
   nmol polyP = 1,5 x (μM phosphat / 10)
   HINWEIS: Die kurvenbasierte Standardmethode in Schritt 5 bestimmt die Konzentration von Phosphat (in μM) in jeder 100 μl polyP-Probe, die in Schritt 4.2 aliquotiert wurde. Um diese Konzentration in eine Zahl von nmol umzurechnen, wird 100 μL durch 10⁶ dividiert, um ein Volumen in L zu erhalten, multipliziert mit der Konzentration (μmol ^L-1) und dann multipliziert mit 1.000 (die Anzahl der nmol in einem μmol). Dies reduziert sich auf die Division der Konzentration durch 10. Das in Schritt 3 vorbereitete Gesamtextraktvolumen beträgt 150 μL, so dass es notwendig ist, den resultierenden Wert mit 1,5 zu multiplizieren, um das im gesamten Extrakt vorhandene nmol Phosphat zu berechnen.
2. Normalisieren Sie den zellulären PolyP-Gehalt auf das zelluläre Gesamtprotein, indem nmol polyP durch das mg Gesamtprotein in jeder in Schritt 1.4 bestimmten Probe dividiert wird. Die PolyP-Gehalte werden als die Konzentration des einzelnen freien Phosphats aus PolyP ausgedrückt.
   HINWEIS: In einigen Fällen kann die Menge an polyP-abgeleitetem Phosphat, die in einer Probe vorhanden ist, außerhalb des linearen Bereichs der Phosphat-Standardkurve liegen. Wenn die PolyP-Spiegel sehr hoch sind, kann das überschüssige polyP-haltige Eluat aus Schritt 3.6 je nach Bedarf 1:10 oder 1:100 verdünnt und dann erneut gemessen werden, wie in den Schritten 4 bis 6 beschrieben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
LB Bouillon	Fisher Scientific	BP1427-2	E. coli Wachstumsmedium
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025
Natriumchlorid (NaCl)	Fisher Scientific	S27110
Magnesiumchlorid (MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
Bradford-Reagenz	Bio-Rad	5000205 Tris-Puffer
	Fisher Scientific	BP1525
Salzsäure (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	zur Einstellung des pH-Wertes von Tris-gepufferten Lösungen
Kaliumchlorid (KCl)	Fisher Scientific	P217500
Glycerin	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS Medium Gemisch	Teknova	M2101	E. coli Wachstumsmedium
Glukose	Fisher Scientific	D161
monobasisches Kaliumphosphat (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	BP362-500
zweibasisches Kaliumphosphat (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500
dehydrierter Hefeextrakt	Fisher Scientific	DF0886-17-0
Trypton	Fisher Scientific	BP1421-500
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Fisher Scientific	M63-50
Mangansulfat-Monohydrat	Fisher Scientific	M113-500
Guanidin-Isothiocyanat	Fisher Scientific	BP221-250
Rinderserumalbumin (proteasefrei)	Fisher Scientific	BP9703100
96-Well-Platten mit klarem Flachboden	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	beliebig Klare 96-Well-Platte funktioniert Tecan
M1000 Unendlicher Plattenleser	Tecan, Inc.	nicht anwendbar	Jedes Plattenlesegerät, das in der Lage ist, die Extinktion bei 595 und 882 nm zu messen, funktioniert
mit Ethanol	Fisher Scientific	04-355-451
Siliziumdioxid-Membran-Spin-Säulen	Epoch Life Science	1910-050/250
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen	Fisher Scientific
Ammoniumacetat	Fisher Scientific	A637-500
Antimon-Kaliumtartrat	Fisher Scientific	AAA1088922
4 N Schwefelsäure (H₂SO₄)	Fisher Scientific	SA818-500
Ammoniumheptamolybdat	Fisher Scientific	AAA1376630
Ascorbinsäure	Fisher Scientific	AC401471000

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