Dieses Video zeigt die Vorbehandlung von Makrophagen mit Legionella pneumophila Vesikeln der äußeren Membran (OMVs), um deren Wirkung auf die bakterielle Replikation zu untersuchen. Durch die Veränderung der Immunsignalisierung des Wirts machen OMVs Makrophagen durchlässiger für Infektionen. Höhere Koloniezahlen in behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen deuten darauf hin, dass OMVs die Replikation von L. pneumophila in Makrophagen fördern.
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Methodenartikel
Assay der Legionella pneumophila-Replikation in Makrophagen, die mit äußeren Membranvesikeln vorbehandelt wurden
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29. August 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Makrophagen vorbehandeln
- Bereiten Sie THP-1-Zellen (Tohoku Hospital Pediatrics-1-Zellen, eine humane monozytäre Leukämie-Zelllinie) vor.
HINWEIS: THP-1 ist eine monozytäre Zelllinie, die von einem Leukämiepatienten abgeleitet wurde.- Fügen Sie 2x105 THP-1-Zellen pro 24 Wells hinzu und differenzieren Sie sie durch Zugabe von 20 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in Makrophagen-ähnliche Zellen. 24 h bei 37 °C inkubieren.
- Ersetzen Sie das Medium durch 500 μl frisches Medium und inkubieren Sie es für weitere 24 Stunden; das optimale Medium für THP-1-Zellen besteht aus Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 hoher Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum.
- Isolierung der murinen Makrophagen aus dem Knochenmark (mBMDM).
- Behandeln Sie THP-1-abgeleitete Makrophagen oder mBMDM mit Vesikeln der äußeren Membran (OMVs).
- Tauen Sie die OMVs auf und fügen Sie sie den menschlichen oder murinen Makrophagen entsprechend ihrer Proteinmenge (0,1, 1 und 10 μg/ml) hinzu. Inkubieren Sie die Makrophagen mit OMVs bei 37 °C für mindestens 20 h.
2. Infizieren Sie die Makrophagen und beurteilen Sie die bakterielle Replikation mit einem KBE (Colony-Forming Unit) Assay
- Verwenden Sie Legionella pneumophila, vorbehandelte THP-1-Zellen oder mBMDM aus Schritt 4.3 und nicht vorbehandelte Makrophagen als Kontrollen (2x105/24 Wells). Tauschen Sie das Medium nicht aus.
- Infizieren Sie THP-1-Zellen mit L. pneumophila Corby WT und mBMDM mit einer flagellin-fehlenden Mutante von L. pneumophila Corby (beide mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,5; 1x105 L. pneumophila/24 Wells) und inkubieren Sie für 24 bzw. 48 Stunden.
- Die Zellen werden in ihrem Medium unter Zugabe von Saponin (Endkonzentration: 0,1%) lysiert und 5 min bei 37 °C inkubiert.
- Resuspendieren Sie die Bakterien durch Pipettieren und überführen Sie die Suspension in ein Reaktionsgefäß. Bereiten Sie serielle Verdünnungen des L. pneumophila-haltigen Mediums in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
- 50 μl der erforderlichen Verdünnungen auf Agarplatten mit gepuffertem Aktivkohlehefeextrakt (BCYE) auftragen und 3 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Zählen Sie visuell die gebildeten Kolonien. Berechnen Sie die CFU
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Normalisieren Sie das Ergebnis der CFU-Zählung auf nicht vorbehandelte, aber infizierte Makrophagen, die auf 100% eingestellt sind.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland) | 82.1473 | |
| Aktivkohle | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland) | X865.2 | |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland) | 5210.2 | |
| Columbia-Agar mit 5 % Schafsblut | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland) | 254005 | |
| Eisennitrat-Nonahydrat | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland) | 5632.1 | |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland) | 10270-106 | |
| Heracell 240i Kohlendioxid-Inkubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland | )40830469 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland) | 75004515 | |
| Impfschleife | Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland) | 86.1567.010 | |
| L. pneumophila Corby | --- | --- | Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Antje Flieger (RKI, Berlin, Deutschland) |
| L. pneumophila Corby ΔflaA | --- | --- | Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlin, Deutschland) |
| mBMDM | ------ | Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland) und Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universität Duisburg Essen, Essen, Deutschland) | |
| PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Deutschland) | L 1825 | |
| Phorbol 12-Myristat 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland) | P8139-1MG | |
| Rotierender Schüttler (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland) | SHKE6000 | |
| RPMI 1640 High Glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland) | 11875-093 | |
| Saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland) | 9622.1 | |
| Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
| THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland) | 88081201-1VL | |
| Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland) | ||
| Hefeextrakt | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland) | 2363.2 |
