Ein Verfahren zur Bakterienernte und mechanischen Lyse

Zusammenfassung

Quelle: Mercier, N., et al. MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien. (2021)

Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Ernte von Bakterienzellen und deren mechanischer Lyse, um intrazelluläre Inhalte freizusetzen.

Protokoll

1. Ernte von Bakterien

VORSICHT: Dieser Schritt beinhaltet den Umgang mit pathogenen Bakterien.

1. Züchten Sie eine Kolonie von Stämmen, die entweder pCN51-P3-MS2-sRNA- oder pCN51-P3-MS2-Plasmide in 3 ml Hirn-Herz-Infusionsmedium (BHI) enthalten, das mit Erythromycin (10 μg/μl) in Duplikaten ergänzt wird.
2. Verdünnen Sie jede Übernachtkultur in 50 ml (≈1/100) frischem BHI-Medium, das mit Erythromycin (10 μg/μl) versetzt wird, um einen OD_{600 nm} von 0,05 zu erreichen. Verwenden Sie sterilisierte 250-ml-Kolben (5:1-Verhältnis von Kolben zu Medium).
   HINWEIS: Die Medium- und Wachstumsbedingungen sollten entsprechend dem Expressionsmuster der untersuchten sRNA eingestellt werden.
3. Züchten Sie Kulturen bei 37°C und Schütteln bei 180 U/min für 6 Stunden.
4. Übertragen Sie jede Kultur in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Bei 2.900 x g während 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
6. Bewahren Sie die Pellets auf Eis auf und führen Sie direkt eine mechanische Zelllyse durch oder frieren Sie die Pellets ein und lagern Sie sie bei -80 °C.

2. Mechanische Zelllyse

ACHTUNG: Die folgenden Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden und die Puffer müssen eine Temperatur von 4 °C aufweisen. Tragen Sie Handschuhe und treffen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen, um die Proben vor RNasen zu schützen.

1. Resuspendieren Sie die Pellets (Schritt 1.6) in 5 mL Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT).
2. Die resuspendierten Zellen werden in 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 3,5 g Kieselsäurekügelchen (0,1 mm) überführt.
3. Führen Sie die Röhrchen in ein mechanisches Zelllyseinstrument ein. Führen Sie einen Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s durch.
   HINWEIS: Wenn ein Zyklus nicht ausreicht, um Zellen zu brechen, lassen Sie das Gerät 5 Minuten lang abkühlen, während Sie die Proben auf Eis halten. Wiederholen Sie dann einen weiteren Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s. Die Effizienz der Zelllyse kann durch Plattieren des Überstands auf einer BHI-Agar-Platte getestet werden.
4. Bei 15.700 x g 15 min zentrifugieren. Den Überstand zurückgewinnen und auf Eis legen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352070
50 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352051
250 mL Kulturflasche	Dominique Dutscher	2515074	Bakterienkulturen
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	Sigma-Aldrich	53286	Wachstumsmedium
Erythromycin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Wachstumsmedium
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mechanische Lyse
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Mechanische Lyse
FastPrep Gerät	MP Biomedicals	116004500
Spektralphotometer für mechanische Lyse Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bakterienkulturen