Isolierung kleiner regulatorischer RNA-gebundener bakterieller Ziel-RNA mittels Affinitätsreinigung

Zusammenfassung

Quelle: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Isolierung von MS2-markierter kleiner regulatorischer RNA (sRNA), die an ihre bakterielle Ziel-RNA gebunden ist, mittels Affinitätsreinigung mit einer Fusion des Maltose-bindenden Proteins (MBP) und des MS2-Hüllproteins, das auf Amyloseharz immobilisiert ist.

Protokoll

Puffer und Medien

Bereiten Sie für MAPS-Experimente die folgenden Puffer und Medien vor:- Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)- Puffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM Maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)

Vorbereitung der Säule

VORSICHT: Achten Sie darauf, das Amyloseharz nicht trocknen zu lassen. Verschließen Sie die Säule bei Bedarf mit einer Endkappe. Bereiten Sie alle Lösungen vor, bevor Sie mit der Affinitätsreinigung beginnen.

1. Stellen Sie eine Chromatographiesäule in ein Säulengestell.
2. Entfernen Sie die Säulenspitze und waschen Sie die Säule mit Reinstwasser.
3. 300 μl Amyloseharz zugeben.
4. Waschen Sie die Säule mit 10 mL Puffer A.
5. Verdünnen Sie 1.200 pmol MBP (Maltose-bindendes Protein)-MS2-Protein in 6 ml Puffer A und laden Sie es in die Säule.
6. Waschen Sie die Säule mit 10 mL Puffer A.

MS2-Affinitätsreinigung (Abbildung 1)

1. Laden Sie das Zelllysat in die Säule.
   HINWEIS: Bewahren Sie 1 ml des Zelllysats (Rohextrakt, CE) auf, um die Gesamt-RNA zu extrahieren und eine Northern-Blot- und Transkriptomanalyse durchzuführen.
2. Sammeln Sie die Durchflussfraktion (FT) in einem sauberen Auffangröhrchen.
3. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit 10 mL Puffer A. Sammeln Sie die Waschfraktion (W).
4. Eluieren Sie die Säule mit 1 mL Puffer E und sammeln Sie die Elutionsfraktion (E) in einem 2 mL Mikroröhrchen.
5. Bewahren Sie alle gesammelten Fraktionen bis zur RNA-Extraktion auf Eis auf oder frieren Sie sie für die spätere Verwendung bei -20 °C ein.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung des MAPS-Protokolls, angepasst an Staphylococcus aureus. Von der Plasmidkonstruktion bis zur Datenanalyse.

Materialien