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1. Vorbereitung von Bakterienstämmen oder Mutantenbibliotheken
1. Streichen Sie die zu testenden Stämme auf geeigneten Agarplatten aus. Dies sind Lagerplatten für das Experiment.
1. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei der gewünschten Temperatur, um einzelne Kolonien zu erhalten. Für dieses Experiment kultivierte man K. pneumoniae (NTUH-K2044 und ATCC43816 Stämme) auf Luria-Bouillon (LB)-Agar bei 37 °C und S. pneumoniae (23F Wildtyp und 23F Δcps) auf Blutagar in einem befeuchteten Kerzenglas bei 37 °C.
2. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von einer Vorratsplatte (Schritt 1.1), um 10 ml geeignete Brühe mit einer sterilen Schlaufe oder einem Cocktailseriesel zu impfen. Für das Screening von zufälligen Mutantenbibliotheken inokulieren Sie die Bouillon mit 10 μl des zufälligen Mutantenbibliotheksbestands (TraDIS Library).
1. Inkubieren Sie K. pneumoniae-Stämme in salzarmen LB-Medien bei 37 °C unter Schütteln und S. pneumoniae-Stämme in Hirn-Herz-Infusionsmedien (BHI) statisch bei 37 °C.
2. Übertragen Sie die Übernachtkultur auf ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie in einer Tischzentrifuge für 10 Minuten bei 3.200 x g in ausschwenkbaren Eimern mit 15-ml-Röhrcheneinsätzen und aerosoldichten Deckeln.
3. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
HINWEIS: Entsorgen Sie den Überstand über den entsprechenden Weg über flüssige biologische Abfälle im Labor. Der Zweck der Zentrifugations- und Resuspensionsschritte (1.2.2 und 1.2.3) besteht darin, die Bakterien für eine einfache Visualisierung auf dem Gradienten zu konzentrieren. Auf Wunsch können Bakterienkulturen direkt auf den Gradienten geladen werden. Stark verkapselte Stämme bilden möglicherweise kein dichtes Pellet. In diesem Fall entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne Bakterienzellen zu entfernen, fügen Sie 1x PBS zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu und resuspendieren Sie das Pellet. Setzen Sie das Protokoll mit Schritt 1.2.5 fort.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL 1x PBS. Die Zellen sind nun einsatzbereit.
HINWEIS: Die Dichte der bakteriellen Zellsuspension ist nicht kritisch, muss aber für die Visualisierung im Gradienten ausreichend sein. Es wird ein Mindest-OD600 (optische Dichte bei 600 nm) von 4 empfohlen.