Trennung der Bakterien nach Kapselmenge unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten

Zusammenfassung

Quelle: Feltwell, T., et.al. Trennung von Bakterien nach Kapselmenge unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten zur Trennung von Bakterienstämmen basierend auf der Kapselmenge. Durch das Zentrifugieren einer Transposon-Mutantenbibliothek durch den Gradienten lokalisieren sich Bakterien mit unterschiedlichen Kapseldichten in unterschiedlichen Schichten. Die abgetrennten Fraktionen können dann für die nachgelagerte Analyse aufgefangen werden.

Protokoll

1. Hinzufügen von vorbereiteten Zellen zu Gradienten und Trennung durch Zentrifugation

1. Geben Sie 600 μl vorbereitete Zellen sehr langsam und ohne Vermischung der Grenzfläche an die Oberseite des Gradienten im Röhrchen.
2. Legen Sie die Schläuche in Schlauchadapter und wiegen Sie die kombinierten Adapter und Schläuche, um sicherzustellen, dass sie ausbalanciert sind.
   1. Platzieren Sie die Röhrenadapter in einem Festwinkelrotor in einer Tischzentrifuge. 30 min bei 3.000 x g zentrifugieren.
   2. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Röhrchen, legen Sie sie in ein geeignetes Gestell und fotografieren Sie die Ergebnisse als Protokoll.
3. Rückgewinnung der bakteriellen Fraktionen für die Uronsäure-Quantifizierung oder DNA-Extraktion.
   1. Wenn nachgelagerte Anwendungen nicht erforderlich sind, entsorgen Sie die Proben/Gradienten über den entsprechenden Weg für flüssige biologische Abfälle im Labor.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Trennung für neue Spezies/Bakterienstämme zu validieren. Einzelne Fraktionen aus dem Gradienten sollten durch Mikroskopie, durch Uronsäure-Assay oder einen anderen geeigneten quantitativen Assay untersucht werden, um den Kapselphänotyp jeder Fraktion zu bestätigen. Besteht das Ziel darin, auf der Grundlage der Aggregation oder der Zellgröße zu trennen, sollten unabhängige geeignete Assays verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Zentrifuge 5810R mit Rotor A-4-81 und 500ml Eimer	Eppendorf	5810 718.007
Adapter für 15 ml Röhrchen	Eppendorf	5810 722.004
Festwinkelrotor F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2,6 - 7 ml Röhrchenadapter	Eppendorf	5804 739.000
Zentrifuge 5424 inkl. Rotor FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 ml Polypropylen Rundbodenröhrchen	Falcon	352063