Aptamer-assistierte Akustophorese zur mikrofluidischen Trennung gramnegativer Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Choi, H. J., et al. Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung von gramnegativen Bakterien mit Hilfe von Aptamer-Affinitätsperlen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Methode zur selektiven Trennung von gramnegativen Bakterien aus einer gemischten Bakterienprobe unter Verwendung von Aptamer-beschichteten Mikrokügelchen und akustischen Kräften innerhalb eines mikrofluidischen Chips.

Protokoll

1. Aufbau und Betrieb der Akustophorese
   1. Verbinden Sie Polyetheretherketon (PEEK)-Röhrchen mit den beiden Einlässen für die Injektion von zwei Proben und Puffer sowie den beiden Ausgängen zum Sammeln und Entleeren von Abfällen (Abbildung 1).
   2. Füllen Sie den mikrofluidischen Akustophoresekanal manuell mit blasenfreiem demineralisiertem Wasser mit einer 10 mL Spritze.
   3. Bereiten Sie einen Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen vor, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Füllen Sie dann die Fläschchen zur Hälfte mit Probe bzw. Puffer mit zwei Löchern in ihren Kappen und verbinden Sie sie mit dem Chipeinlass.
      HINWEIS: Ein Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen kann durch mehrere Präzisionsdruckregler ersetzt werden. Am Puffereinlass wird ein Puffer, der in der Lage ist, eine laminare Strömung zu erzeugen, die verhindert, dass sich die Probe während der Probeninjektion in die Mitte bewegt, durch einen Durchflussregler injiziert.
   4. Nach der Vorbereitung des Geräts injizieren Sie die Probe und den Puffer, indem Sie mit dem Präzisionsdruckregler einen Druck von 2 kPa auf den Probeneinlass und 4 kPa auf den Puffereinlass ausüben.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte der Injektionsdruck des Puffers für eine gleichmäßige laminare Strömung höher sein als der Injektionsdruck der Probe. Der Durchfluss wird durch einen Durchflussregler gesteuert, der an dem Aspirator befestigt ist und mit dem Einlasskanal verbunden ist.
   5. Fokussieren Sie sich mit dem piezoelektrischen Wandler (PZT) auf eine Perle, um sie in die Mitte des mikrofluidischen Kanals zu bewegen, während Sie sie durch das Mikroskop prüfen.
      HINWEIS: Je größer die Perle, desto größer ist die Auswirkung auf die Wellenform, sodass sie sich leichter am Knotenpunkt ausrichten lässt. Ein Funktionsgenerator mit einem Verstärker legt Strom an den PZT an, um eine Sinuswelle im Mikrokanal zu erzeugen. Da der obere und untere Teil des Mikrokanals aus Glas bestehen, wird die erzeugte Sinuswelle reflektiert und erzeugt einen Knotenpunkt.
   6. Erzeugen Sie mit einem einkanaligen Funktionsgenerator eine Resonanzfrequenz von 3,66 MHz und verstärken Sie ein typisches Signal mit einem Leistungsverstärker um 16 dB (etwa neunfach) (Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Resonanzfrequenz des Aktuators muss mit der Größe des Kanals übereinstimmen, da der Kanal quadratisch ist, arbeitet der PZT mit einer genauen Frequenz, um einen einzelnen Knoten zu erzeugen.
   7. Beobachten Sie die Trenn- und Anreicherungsprozesse auf dem akustofluidischen Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit 1.200 fps (Bilder pro Sekunde) arbeitet.
   8. Quantifizieren und analysieren Sie das Vorhandensein oder Fehlen von gramnegativen (GN) Bakterien und grampositiven (GP) Bakterien, indem Sie die mit der Fluoreszenzmikroskopkamera aufgenommenen Bilder der bakteriengebundenen Kügelchen und der durch die Sammel- und Abfallauslassproben ausgeschiedenen Bakterien überprüfen.
      HINWEIS: Mikrokügelchen mit Puffer, Bakterien und Aptameren passieren den Hauptkanal, und die Mikrokügelchen werden über eine durch das PZT induzierte In-Chip-Akustophorese zentral ausgerichtet. Schließlich werden Mikrokügelchen, die GN-Bakterien gebunden haben, am Auffangauslass gesammelt und die nicht gesammelten Bakterien werden durch den Abfallauslass ausgetragen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des akustofluidischen Systems, das zum Trennen und Sammeln von Zellen verwendet wird. Die Proben- oder Pufferlösung wird durch den Durchflussregler in die Einlassöffnung injiziert. Für die Bead-Zentr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 μm Streptavidin-beschichtete Mikrokügelchen	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer Affinitätskügelchen
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'RNA	für die Bakterienkonjugation
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Zielbakterien
Funktionsgenerator	GW Instek	AFG-2225	Frequenz erzeugen
Hochgeschwindigkeitskamera	Photron	FASTCAM Mini	Beobachtung der Trennung
KOVAX-SPRITZE 10 mL Spritze	Koreavaccine	22G-10ML	Füllen Sie den mikrofluidischen Akustophoresekanal mit blasenfreiem demineralisiertem Wasser.
Mikroskop	Olympus Corp.	IX-81	Beobachtung der Trennung
von PEEK-Rohren	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Partikel injizieren oder sammeln
Piezoelektrischer Wandler	Fuji Ceramics	C-213	Spezifische Welle im Kanal erzeugen
Leistungsverstärker	Amplifier Research	75A250A	Frequenz verstärken
Druckregler/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Steuerung des Luftdruck-/Durchflussreglers