In-vivo-Assay zur Korrelation der bakteriellen Biolumineszenz mit der Zelldichte

Zusammenfassung

Quelle: Brodl, E., et al. In situ Messung und Korrelation von Zelldichte und Lichtemission von biolumineszierenden Bakterien. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt die Messung und Korrelation der Biolumineszenz mit der Zelldichte in transformierten Bakterien. Eine einzelne Bakterienkolonie wird verwendet, um eine Flüssigkultur zu initiieren. Die Kultur wird in einer Vertiefung mit der gewünschten Zellkonzentration platziert. Ein Antibiotikum und ein Induktor werden hinzugefügt, um das für die bakterielle Biolumineszenz erforderliche Gen zu exprimieren. Die Messwerte für Absorption und Biolumineszenz werden in regelmäßigen Abständen mit einem Platten-Reader durchgeführt.

Protokoll

1. Design, Herstellung und Expression des Lux-Operons bei Escherichia coli

Hinweis: Informationen zu den in diesem Abschnitt verwendeten kommerziellen Kits finden Sie in der Materialtabelle.

1. Für die Übertragung des Lux-Operons in E. coli wählen Sie einen Standard-pET-Vektor mit geeigneten Restriktionsstellen und einem interessierenden Antibiotikaresistenzgen (z. B. pET28a; NcoI, XhoI, Kanamycin).
2. Entwerfen Sie die Fragmente und überlappenden Primer für die Gibson-Assemblierung basierend auf der DNA-Sequenz von Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Richten Sie eine Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Reaktion mit den entworfenen Primern und der isolierten genomischen DNA (Desoxyribonukleinsäure) von Photobacterium mandapamensis 27561 als Template ein.
   HINWEIS: Die Isolierung der genomischen DNA des jeweiligen Bakterienstamms erhöht die Wirksamkeit der PCR.
4. Aufreinigung des PCR-Produkts durch Spin-Säulen-Aufreinigung.
5. Führen Sie einen Restriktionsaufschluss des isolierten pET28a-Vektors mit NcoI und XhoI bei 37 °C für 45 min durch.
6. Aufreinigung des linearisierten Vektors und der PCR-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Aufreinigung der Spin-Säulen.
7. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration jedes Fragments und des linearisierten Vektors und berechnen Sie die optimalen Mengen für die Assemblierung gemäß dem Protokoll.
   HINWEIS: Die Wirksamkeit der Assemblierung hängt von der Größe und Anzahl der Fragmente ab und muss gemäß dem Protokoll des Herstellers angepasst werden.
8. Nachdem Sie alle Fragmente und den Puffer in einem PCR-Röhrchen kombiniert haben, inkubieren Sie die Assemblierungsmischung in einer PCR-Maschine bei 50 °C für 1 h.
9. Transformieren Sie das assemblierte Vektorprodukt gemäß den Standardtransformationsprotokollen für die bakterielle Plasmidtransformation von E. coli in ein geeignetes E. coli-System für die Plasmidreplikation mit hoher Ausbeute (z. B. E. coli TOP10 oder XL-1).
10. Entnehmen Sie Kolonien aus der Transformationsplatte und streifen Sie neue Platten für die DNA-Isolierung auf.
11. Isolierung von Plasmid-DNA gemäß Standardprotokollen.
12. Um die korrekte Assemblierung des Plasmids, einschließlich aller Fragmente, zu überprüfen, führen Sie zunächst eine Kolonie-PCR gemäß Standardprotokollen mit Primern durch, die für jedes assemblierte Fragment spezifisch sind.
13. Zusätzlich zur Kolonie-PCR und der anschließenden Agarose-Gelelektrophorese bereiten Sie alle isolierten Assemblierungsvektoren für die DNA-Sequenzierung vor, um die korrekte Assemblierung und die korrekten DNA-Sequenzen zu überprüfen.
14. Transformieren Sie das verifizierte Plasmid gemäß den Standardtransformationsprotokollen für die bakterielle Plasmidtransformation von E. coli in ein geeignetes E. coli-System für die Proteinproduktion mit hoher Ausbeute (z. B. E. coli BL21).
    HINWEIS: Fahren Sie direkt mit dem untenstehenden Expressionsprotokoll fort. Für eine längere Lagerung empfiehlt sich die Aufbereitung einer Glycerinbrühe.

2. Expression von modifizierten E. coli-Stämmen

1. : Bereiten Sie eine Overnight-Kultur (ONC) für die Expression durch Inokulation eines geeigneten Volumens an Luria-Bertani (LB)-Medium (z. B. 100 ml) mit dem zuvor vorbereiteten Glycerinbestand der E. coli BL21-Zellen vor, die mit dem assemblierten Plasmid transformiert wurden, oder direkt von einer Transformationsplatte. Fügen Sie 100 μl Kanamycin (50 mg/ml; Antibiotikaresistenzgen von pET28a) hinzu und inkubieren Sie das ONC bei 37 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler über Nacht.
2. Beimpfen Sie die Hauptexpressionskultur (z. B. 800 ml LB-Medium) mit 8 ml ONC und fügen Sie 800 μl Kanamycin (50 mg/ml) hinzu.
3. Die Hauptkultur wird bei 37 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler inkubiert, bis die Zelldichte einen OD₆₀₀ von 0,6 - 0,8 (ca. 2,5 h) erreicht.
4. Die Inkubationstemperatur auf 28 °C reduzieren.
5. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von Propyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM.
   HINWEIS: Empirische Tests zeigten, dass die Absenkung der Temperatur auf 28 °C die höchste Lichtintensität ergab.
6. Beobachten Sie die Zellen, bis sie zu glänzen beginnen (ca. 1 h).
   HINWEIS: Je nach Zweck der Expression werden die Zellen bis zum nächsten Tag gezüchtet und dann geerntet, oder die Zellen können so lange geschüttelt werden, wie sie glänzen (maximal 48 h). Die Ernte der Zellen und die Reinigung aller Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.

3. Expression von bakteriellen biolumineszierenden Stämmen

HINWEIS: Bakterielle biolumineszierende Stämme benötigen für das Wachstum und die Lichtproduktion ein spezifisches Wachstumsmedium/künstliches Meerwassermedium.

1. Bereiten Sie ein künstliches Meerwassermedium vor, das aus zwei getrennt hergestellten Medienkomponenten besteht.
   HINWEIS: Die folgenden Mengen gelten für 1 l flüssiges Medium oder 1 l Agarmedium.
   1. Für das künstliche Meerwassermedium wiegen Sie die folgenden Salze ein: 28,13 g NaCl (Natriumchlorid), 0,77 g KCl (Kaliumchlorid), 1,60 g CaCl₂ · 2H₂O (Calciumchlorid-Dihydrat), 4,80 g MgCl₂ · 6H₂O (Magnesiumchlorid-Hexahydrat), 0,11 g NaHCO₃ (Natriumbicarbonat) und 3,50 g MgSO₄ · 7H₂O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat).
   2. 1 l destilliertes Wasser hinzufügen und alle Bestandteile auflösen.
   3. Für LB-Medium wiegen Sie die folgenden Zutaten ein: 10 g Hefeextrakt, 10 g Pepton und für Agarplatten zusätzlich 20 g Agar.
   4. Fügen Sie 250 mL Leitungswasser hinzu und lösen Sie die Bestandteile auf.
   5. Beide vorbereiteten Medien separat bei 121 °C für 20 min autoklavieren.
   6. Für Agarplatten direkt nach dem Autoklavieren 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstlichem Meerwassermedium mischen und Platten vorbereiten.
   7. Kombinieren Sie für flüssiges Medium 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstlichem Meerwassermedium, entweder direkt nach dem Autoklavieren oder beim Abkühlen.
      HINWEIS: Das künstliche Meerwassermedium kann durch Salzfällungen trüb werden.
2. Streifen Sie die bakteriellen biolumineszierenden Stämme auf künstliche Meerwassermedium-Agarplatten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 24 - 30 °C.
   HINWEIS: Eine Langzeitlagerung von Bakterienstämmen wird normalerweise durch das Einfrieren von Glycerinbeständen der Bakterienkultur erreicht. Die Stämme sollten immer zuerst auf die Agarplatten gestreift werden, um einheitliche Startbedingungen für alle Stämme zu gewährleisten, bevor sie für Flüssigkulturen verwendet werden, da es nach dem Auftauen zu einer Verzögerungsphase des Wachstums kommt.
3. Bereiten Sie einen ONC vor, indem Sie 100 ml künstliches Meerwassermedium mit einer einzigen Kolonie von der Platte beimpfen. Inkubieren Sie den ONC bei 24 - 30 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler über Nacht.
4. Beimpfen Sie 800 mL künstliches Meerwassermedium mit 8 mL ONC.
5. Inkubieren Sie die Bakterienzellen bei 24 - 30 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler.
   HINWEIS: Das Lichtintensitätsprofil von biolumineszierenden Bakterien variiert stark mit der Temperatur. Abhängig von den Regulationsmechanismen der Lichtproduktion des jeweiligen Bakterienstammes kann die Lichtemission nach ca. 1 - 6 h einsetzen.
6. Beobachten Sie bakterielle Zellkulturen, bis sie zu glänzen beginnen (ca. 1 - 6 h).
   HINWEIS: Je nach Zweck der Expression werden die Zellen bis zum nächsten Tag gezüchtet und dann geerntet, oder die Zellen können so lange geschüttelt werden, wie sie glänzen. Die Ernte der Zellen und die Reinigung aller Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.

4. In-vivo-Aktivitätsassay für bakterielle Biolumineszenzstämme und modifizierte E. coli-Stämme

HINWEIS: Eine Langzeitlagerung der Stämme wird normalerweise durch das Einfrieren der Glycerinbestände der Bakterienkultur erreicht. Die Stämme sollten immer zuerst auf die Agarplatten gestreift werden, um einheitliche Startbedingungen für alle Stämme zu gewährleisten, bevor sie für Flüssigkulturen verwendet werden, da es nach dem Auftauen zu einer Verzögerungsphase des Wachstums kommt.

1. Streichen Sie den gewünschten biolumineszierenden Bakterienstamm oder modifizierten E. coli-Stamm auf eine Agarplatte und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 28 °C.
   HINWEIS: Die Inkubationstemperatur kann von Stamm zu Stamm variieren und muss empirisch ausgewertet werden. Um biolumineszierende Bakterienstämme mit modifizierten E. coli-Stämmen vergleichen zu können, müssen die Wachstumsbedingungen identisch sein.
2. Beimpfen Sie 3 mL Medium mit dem jeweiligen Stamm mit einer einzigen Kolonie aus einer Agarplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 28 °C und 180 U/min in einem Inkubatorschüttler für ca. 1 - 2 h.
3. Messen Sie die Zelldichte einer 1:10-Verdünnung der Flüssigkultur bei 650 nm. Berechnen Sie das Verhältnis und das Volumen für eine 1-ml-Kultur mit einem OD650 von 0,05.
   HINWEIS: Der anschließende Platten-Reader-Assay bestimmt die Zelldichte bei 650 nm, um Interferenzen durch die Lichtemission der Stämme zu vermeiden.
4. Pipettieren Sie das berechnete Volumen der Kultur und des Mediums in eine 24-Well-Platte mit schwarzen Wänden und Glasboden. Für den modifizierten E. coli-Stamm fügen Sie den Proben 1 μl Kanamycin (Antibiotikaresistenz des pET28a-Vektors) und 1 μl IPTG (Induktion der Genexpression) hinzu. Setzen Sie einen Deckel auf die Platte, um eine Verdunstung während der Messungen zu vermeiden.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass der pET28a-Vektor, der das gesamte Lux-Operon enthält, nicht durch die E. coli-Kultur verloren geht, muss Kanamycin zu jeder E. coli-Probe in den Plattenvertiefungen hinzugefügt werden und um sicherzustellen, dass die Lichtproduktion der E. coli-Zellen gemessen werden kann. Die Genexpression muss durch IPTG induziert werden. Um Übersprechen und Messstörungen zu vermeiden, zeigten schwarz wandige Well-Platten mit Glasboden und transparenten Deckeln die besten Ergebnisse. Trotzdem kann ein Übersprechen beobachtet werden, und die Positionen der Vertiefungen müssen sorgfältig gewählt werden.
5. Starten Sie die Messung in einem Plattenleser.
   HINWEIS: Das Protokoll des Plattenlesers basiert auf einem speziell für diesen Assay entwickelten Skript, das zwei Messungen, Absorption und Biolumineszenz, kombiniert. Die Datenpunkte werden alle 10 min mit ständigem Schütteln zwischen den Messungen und einer konstanten Temperatur von 28 °C gesammelt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NEBuilder High-Fidelity DNA-Assembly Klonierungskit	New England Biolabs Inc.	E2621S	für 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerase	Thermo Scientific	F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Genomisches DNA-Aufreinigungskit	Thermo Scientific	K0721	für 50 rxn-Restriktionsenzyme
und Puffer (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV Gel- und PCR-Clean-Up-Kit	Promega	A9282	für 250 rxn
Monarch DNA-Gel-Extraktionskit	New England Biolabs Inc.	#T1020S	für 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	für 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polymerase	Promega	M7841
24-Well schwarze Senoplate mit Glasboden	Greiner Bio One 662892
FLUOStar Omega Plate Reader	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analyse Software	BMG Labtech		Version 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Inkubator Shaker	Infors AG