Züchtung von Magnetospirillum-Bakterien und Bewertung ihres magnetotaktischen Verhaltens

Zusammenfassung

Quelle: Le Nagard, L., et al. Wachsende magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt, wie Magnetospirillum-Bakterien unter mikroaeroben Bedingungen sowohl mit flüssigen als auch mit halbfesten Medien kultiviert werden können. Es zeigt die Bildung einer sichtbaren Bakterienbande an der oxisch-anoxischen Grenzfläche und deren Aufwärtswanderung, wenn der Sauerstoff erschöpft ist. Das Video zeigt auch, wie man das magnetotaktische Verhalten beurteilen kann, indem man das Richtungsschwimmen als Reaktion auf ein Magnetfeld beobachtet.

Protokoll

1. Inokulation von magnetotaktischen Bakterien (MTB)

HINWEIS: Die Kulturen der Stämme AMB-1, MS-1 und MSR-1 können kommerziell bezogen werden (Materialtabelle).

ACHTUNG: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen unter der Flamme eines Bunsenbrenners durch.

1. Inokulation der Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigem Medium
   1. Verschließen Sie eine leere 125-ml-Serumflasche mit einem Butylkautschuk-Stopfen und einem Aluminium-Bördelverschluss. Führen Sie zwei Nadeln durch den Stopfen in die Flasche ein und verbinden Sie eine Spritze mit einer von ihnen. Schließen Sie die Spritze an einen Zylinder mit O₂ an, und zwar über denselben Schlauchtyp, der auch für die N_2-Station verwendet wird.
   2. Lassen Sie O₂ ca. 30 min durch die Flasche strömen, um sicherzustellen, dass die gesamte Luft in der Flasche durch O₂ ersetzt wird. Entfernen Sie beide Nadeln, um einen leichten Überdruck in der Flasche zu ermöglichen, und autoklavieren Sie dann. Lassen Sie die Flasche vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: Um Zeit zu sparen, führen Sie die Schritte 1.1.1 und 1.1.2 während der Medienvorbereitung durch und autoklavieren Sie die Flasche zusammen mit dem Medium oder den Stammlösungen.
   3. Die Verschlüsse sowohl der Flasche des Frischmediums als auch der Flasche O₂ sterilisieren, indem Sie einige Tröpfchen 70%iger Ethanollösung darauf auftragen und durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen.
   Mit
   4. einer sterilen Spritze und einer Nadel 1 ml O₂ aus der Flasche O₂ extrahieren und in die Flasche des Frischmediums überführen. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, dass die Nadel fest auf der Spritze sitzt, um zu vermeiden, dass Luft in die Spritze gelangt.
   5. Wenn Sie das Inokulum aus einer anderen Kultur verwenden, die in einer Glasflasche gezüchtet wurde, sterilisieren Sie die Verschlüsse sowohl der Frischmittelflasche als auch der älteren Kulturflasche, indem Sie einige Tröpfchen 70%iger Ethanollösung darauf auftragen und durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen. Wenn Sie das Inokulum aus einem Röhrchen mit gefrorener Kultur verwenden, lassen Sie es einfach auf Raumtemperatur erwärmen, wobei das Röhrchen unter der Flamme eines Bunsenbrenners verschlossen ist.
   6. Wenn Sie das Inokulum aus einer anderen Kultur verwenden, die in einer Glasflasche gezüchtet wurde, inokulieren Sie 1 ml der älteren Kultur in das frische Medium. Wenn Sie das Impfmittel aus einer gefrorenen Brühe verwenden, inokulieren Sie nur 0,1 ml, um das im Gefrierprozess verwendete Glycerin oder Dimethylsulfoxid (DMSO) zu verdünnen. Verwenden Sie in beiden Fällen eine sterile Nadel und eine sterile Spritze.
   7. Inkubieren Sie die Kultur bei 32 °C und inokulieren Sie sie nach 4 bis 7 Tagen in frisches Medium.
2. Inokulation von MSR-1 in einem halbfesten Medium mit O 2-Gradienten
   1. Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen mit frischem Medium eine gut definierte oxisch-anoxische Grenzfläche (OAI) aufweist, die durch eine rosa- zu farblose Grenzfläche materialisiert wird.
   2. Wenn das Inokulum aus einer anderen halbfesten Kultur mit_{O2-Konzentrationsgradient} stammt, ernten Sie die Bakterien, indem Sie 50 μl der Kultur mit einer sterilen Pipettenspitze pipettieren, die auf die von den Bakterien gebildete Bande gelegt wird. Impfen Sie diese Bakterien langsam an der OAI im frischen Medium (rosa/farblose Grenzfläche), um eine Störung der Grenzfläche zu vermeiden. Wenn das Inokulum aus einer Gefrierkultur stammt, gehen Sie stattdessen auf die gleiche Weise mit 100 μl Inokulum vor.
   3. Verschließen Sie das Röhrchen und lassen Sie die Bakterien zwischen 25 °C und 30 °C wachsen. Auf die gleiche Weise in ein frisches Medium überführen, bevor das Bakterienband die Oberfläche des Mediums erreicht.

2. Beobachtung der Bakterien

1. Sterilisieren Sie den Stopfen der Kulturflasche, indem Sie 70%ige Ethanollösung darauf auftragen und durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen. Für ein halbfestes Medium öffnen Sie das Rohr unter der Flamme eines Bunsenbrenners. Verwenden Sie eine sterile Nadel und eine sterile Spritze, um die Bakterien zu extrahieren.
2. Verwenden Sie die Methode des hängenden Tropfens8, um sicherzustellen, dass die Bakterien sowohl magnetisch als auch beweglich sind.
   HINWEIS: Die Phasenkontrastmikroskopie liefert hervorragende Ergebnisse, ist aber nicht obligatorisch. Geeignet sind Vergrößerungen von 10X bis 60X.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cysteine.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1,0 mL Spritzen	Fischer scientific	B309659
25G x 1 Nadeln	BD	305125
125 mL Serumflaschen	Wheaton	223748
20 mm Aluminiumdichtungen	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimpzange	Wheaton	W225303
Butylkautschuk-Stopfen	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Hungate Rohre	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Septumstopfen, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Glaskultur-Röhrchen	Corning (VWR)	9826-16X