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1. Bereiten Sie MIC-Panel-Verdünnungen
vor
- Bereiten Sie eine Stammlösung mit einem Gehalt von nicht mehr als 1.600 μg/ml Dalbavancin in reinem (reinem) Dimethylsulfoxid (DMSO) in sterilen Glas- oder Kunststoffröhrchen vor und verwenden Sie sie am selben Tag der Zubereitung oder lagern Sie sie bei -20 bis -60 °C oder darunter für die zukünftige Verwendung in einem nicht auftauenden Gefrierschrank. Berücksichtigen Sie beim Wiegen des Pulvers die Wirksamkeit von Dalbavancin, wie sie in der mit dem Pulver erhaltenen Dokumentation angegeben ist.
- Verdünnen Sie die Stoffverdünnung ähnlich wie mit dem Schema mit reinem DMSO in sterilen Glas- oder Kunststoffröhrchen. Verwenden Sie eine Pipette zum Messen des Verdünnungsmittels und eine weitere Pipette zum Hinzufügen des anfänglichen Dalbavancin-Stoffes in das erste Röhrchen. Für jede weitere Dalbavancin-Stammkonzentration wird eine neue Pipette verwendet.
- Bereiten Sie 100-fache Verdünnungen der endgültigen MHK-Panel-Konzentration (Zwischenkonzentrationen) mit sauberem DMSO vor. Kombinieren Sie geeignete Volumina von Quelle und DMSO, um die gewünschte Zwischenkonzentration zu erreichen (die zu verwendenden Volumina hängen von der Anzahl der herzustellenden MHK-Panels ab).
- 0,004 % P80 vorbereiten: Bereiten Sie eine frische Arbeitsstofflösung von 2 % P80 vor, indem Sie 0,1 mL P80 auf 4,9 mL dH₂O hinzufügen. Sterilisieren, indem Sie durch einen 0,22 μm Filter passieren und die Lösung am selben Tag der Zubereitung verwenden. Bereiten Sie 0,004 % P80-Verdünnungsmittel vor, indem Sie eine Verdünnung von 2 % P80 im Verhältnis 1:500 vornehmen (z. B. 0,3 ml 2 % P80 auf 149,7 ml CAMHB).
- Ferner werden die Zwischenkonzentrationen 1:100 in kationenangepasster Müller-Hinton-Bouillon (CAMHB) verdünnt, die mit 0,004 % (v/v) Polysorbat-80 (P-80) und/oder LHB (für Streptokokken) in doppelter Endkonzentration zugegeben wird, da die Zugabe von Inokulum zu einer Verdünnung im Verhältnis 1:2 führt.
2. MIC-Panels vorbereiten
Geben
- Sie 50 μl jeder vorbereiteten Dalbavancin-Lösung in die entsprechenden Vertiefungen des MHK-Panels und geben Sie das Medium nur in eine Vertiefung (Vertiefung der Wachstumskontrolle). Für diesen Schritt kann eine Mehrkanalpipette mit sterilen Spitzen verwendet werden.
- Verwenden Sie die Paneele sofort oder verschließen Sie sie mit Plastikfolie, legen Sie sie in Plastiktüten und legen Sie sie sofort bis zur Verwendung bei ≤ -20 °C (vorzugsweise bei ≤ -60 °C) in einen nicht auftauenden Gefrierschrank. Wenn gefrorene Platten verwendet werden, entfernen Sie die Dichtungen und legen Sie die einzelnen Platten 15 bis 30 Minuten lang auf den Labortisch (bis der Inhalt der Vertiefung aufgetaut ist), bevor Sie mit der Plattenimpfung fortfahren.
3. IMPFEN Sie die MHK-Panels, führen Sie die Reinheit durch und richten Sie die Koloniezählung
ein
- Wählen Sie mehrere gut isolierte Kolonien aus einem 18-24-stündigen Blutagar oder einer anderen nicht-selektiven Agarplatte aus. Berühren Sie die Oberseite jeder Kolonie mit einer sterilen Schlaufe oder einem Tupfer und geben Sie sie auf 1–5 ml CAMHB oder Kochsalzlösung, bis die Trübung einem McFarland-Standard von 0,5 entspricht. Beurteilen Sie die Trübung durch visuellen Vergleich mit dem 0,5 McFarland oder mit einem photometrischen Gerät.
- Verdünnen Sie das Inokulum innerhalb von 15–30 Minuten nach der Zubereitung 1:100 in CAMHB (100 μl in 10 mL CAMHB). Für die meisten Bakterien, die gegen Dalbavancin getestet wurden, mit Ausnahme von S. pneumoniae, ergibt diese Verdünnung eine endgültige Well-Konzentration von 5 × 10 μ KBE/ml (akzeptabler Bereich liegt zwischen 2 und 8 × 10 μ� KBE/ml). Bei S. pneumoniae ist die Bakterienkonzentration auf der Grundlage eines Vergleichs der Trübung mit 0,5 McFarland in der Regel deutlich niedriger. Verdünnen Sie daher das Inokulum 1:25 (400 μL in 10 mL CAMHB + 10% LHB).
- Innerhalb von 15 Minuten nach der Vorbereitung des Inokulums werden 50 μl des endgültigen Inokulums in jede Vertiefung (mit Ausnahme der Vertiefung für die Sterilitätskontrolle) des vorbereiteten MHK-Panels übertragen. Für diesen Schritt kann eine Mehrkanalpipette mit sterilen Spitzen verwendet werden.
- Führen Sie eine Reinheitsprüfung durch, indem Sie ein 1–10 μl Aliquot aus der positiven Wachstumskontrollvertiefung mit einer sterilen Schleife auf einen nicht-selektiven Agar (z. B. Trypticase-Soja-Agar mit 5 % Schafblut) übertragen und verteilen.
- Richten Sie die Koloniezahl ein, indem Sie 10 μl mit einer Einkanalpipette und einer sterilen Spitze aus der Vertiefung der Wachstumskontrolle entnehmen und auf 10 ml Kochsalzlösung (1:1.000 Verdünnung) übertragen. Mischen und übertragen Sie 100 μl mit einer Einkanalpipette und einer sterilen Spitze auf ein geeignetes nicht-selektives Agarmedium (z. B. Trypticase-Soja-Agar mit 5 % Schafblut) und verteilen Sie es mit einer sterilen Schlaufe über die gesamte Agaroberfläche, wobei Sie dies zweimal in verschiedene Richtungen wiederholen, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu gewährleisten (1:10-Verdünnung).
4. Inkubieren Sie MIC-Panels, Koloniezahl und Reinheitsplatten
- Verschließen Sie vor der Inkubation jedes MIC-Panel oder einen Stapel von nicht mehr als vier Panels in einer Plastiktüte mit Plastikband oder mit einer eng anliegenden Kunststoffabdeckung. Alternativ können Sie ein leeres MIC-Panel auf den Stapel von nicht mehr als 4 MIC-Panels legen, ein feuchtes Papiertuch in einen Plastikbehälter legen, MIC-Panels in den Kunststoffbehälter legen und den Behälter sicher mit einem Deckel verschließen. Inkubieren Sie MHK-Paneele in einem Umgebungsluftinkubator bei 35 °C ± 2 °C für 16–20 Stunden (Staphylokokken und Enterokokken) und 20–24 Stunden (Streptokokken) innerhalb von 30 Minuten nach der Inokulation. Inkubieren Sie die Koloniezahl- und Reinheitsplatten unter den gleichen Bedingungen, außer Streptokokken in einem 5%igen CO₂-Inkubator inkubieren.
5. Lesen Sie die MHK- und Koloniezählplatten; Überprüfen Sie die Reinheitsplatte:
- Lesen Sie den MHK als die niedrigste Konzentration ab, die das Bakterienwachstum in den Vertiefungen vollständig hemmt, wie sie mit bloßem Auge erkannt wird.
- Zählen Sie die Völker auf dem Völkerzählteller. Multiplizieren Sie jede Kolonie mit dem Verdünnungsfaktor (1:10.000) (z. B. 50 Kolonien entsprechen 5 × 10⁵ KBE/ml). Ein akzeptabler Bereich liegt bei 20–80 Kolonien (2–8 × 10⁵ KBE/ml) und wird als ungefährer Richtwert verwendet.
- Überprüfen Sie die Reinheitsplatte. Wenn alle Völker den einzelnen Völkern ähnlich sind, kann das Inokulum als rein angesehen werden. Wenn andere Kolonien vorhanden sind, besteht die Möglichkeit, dass eine Verunreinigung im MHK-Panel vorhanden ist, und der Test sollte wiederholt werden.