Nanopartikel-vermittelte Visualisierung des endo-lysosomalen Umbaus in bakteriell infizierten Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, Y., et al. Anwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Untersuchung des Umbaus des endolysosomalen Systems durch intrazelluläre Bakterien. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Verwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Visualisierung des endolysosomalen Umbaus in menschlichen Epithelzellen, die von intrazellulären Bakterien infiziert sind. Nach der bakteriellen Invasion manipulieren die Erreger das Zytoskelett des Wirts und das endolysosomale System und bilden Vakuolen mit röhrenförmigen Fortsätzen, die den Vesikeltransport verändern. Fluoreszenzmarkierte Nanopartikel werden dann verwendet, um diese Veränderungen zu verfolgen, was eine hochauflösende Bildgebung von erregerinduzierten intrazellulären Transportereignissen ermöglicht.

Protokoll

1. Kultur von HeLa-Zellen
   1. HeLa-Zellen, die dauerhaft LAMP1-GFP (Lysosom-associated membrane glycoprotein 1-Green fluorescent protein) exprimieren, werden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und bei 37 °C in einer Atmosphäre gezüchtet, die 5 % CO₂ enthält.
   2. Aussäen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 pro Well in einem 8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi) und inkubieren Sie sie über Nacht (O/N).
2. Kultur von Bakterien
   1. Verwenden Sie Salmonella enterica Serovar Typhimurium NCTC 12023 Wildtyp (WT) Stamm. Zum Vergleich werden mutierte Stämme ΔssaV verwendet, die im SPI2-T3SS defekt sind, und ΔsifA ohne Schlüsseleffektor SifA für SIF. Verwendung von Stämmen, die das Plasmid pFPV25.1 enthalten, für die konstitutive Expression von verstärktem GFP.
      HINWEIS: Bakterienstämme werden routinemäßig in Luria-Bertani-Bouillon (LB) unter Zugabe von 50 μg/ml Carbenicillin (WT) und LB unter Zusatz von 50 μg/ml Carbenicillin und/oder 50 μg/ml Kanamycin (ΔssaV, ΔsifA) kultiviert, die zur Aufrechterhaltung der Plasmide erforderlich sind.
   2. Eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB mit geeigneten Antibiotika impfen und O/N bei 37 ºC unter Schüttelbedingungen zur Belüftung züchten, dann 1:31 in frischem LB verdünnen und das Wachstum 3,5 Stunden lang fortsetzen. Zu diesem Zeitpunkt erreichen die Kulturen die Late-Log-Phase und die Bakterien sind hochgradig invasiv. Eine "Rollentrommel" ist praktisch, um Reagenzglaskulturen mit Belüftung zu inkubieren.
3. Infektion von HeLa-Zellen durch Salmonellen und Gold-BSA-Rhodamin Nanopartikel oder NPs Puls-Chase-Markierung (siehe Abbildung 1 für das Schema)
   1. OD₆₀₀ der subkultivierten Bakterien messen und auf OD₆₀₀ = 0,2 in 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS verdünnen (~3 × 10⁸ KBE/ml), fügen Sie HeLa-Zellen in 8-Well-Kammer-Objektträgern angemessene Mengen an Bakterien hinzu, um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 zu erreichen.
   2. 30 Minuten im Zellinkubator inkubieren, 3 Mal mit PBS waschen, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen (dieser Zeitpunkt wurde auf 0 Stunden nach der Infektion oder 0 Stunden pro Tag festgelegt). 300 μl frisches Nährmedium mit 100 μg/ml Gentamicin zugeben und 1 Stunde lang halten. Ersetzen Sie dann das Medium für den Rest der Inkubationszeit durch frisches Medium mit 10 μg/ml Gentamicin.
   3. Nach 1-stündiger Inkubation mit einem Kulturmedium mit 100 μg/ml Gentamicin wird das Medium durch ein bildgebendes Medium (Eagle's MEM ohne FCS, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumbicarbonat mit 30 mM HEPES, pH 7,4) ersetzt, das 10 μg/ml Gentamicin enthält. Gold-BSA-Rhodamin-NPs werden zu HeLa-Zellen hinzugefügt, um eine Endkonzentration von OD₅₂₀ = 0,1 zu erhalten. (Rinderserumalbumin oder BSA)
      HINWEIS: Gold-BSA-Rhodamin-NPs können den Zellen auch vor der Infektion oder zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. zugesetzt werden.
   4. Entfernen Sie nach 1 Stunde Inkubation das Medium, waschen Sie es 3 Mal mit PBS und fügen Sie für den Rest der Inkubationszeit 300 μl frisches Bildgebungsmedium mit 10 % FCS und 10 μg/ml Gentamicin hinzu.
      HINWEIS: Die Dauer der Inkubation kann je nach Konzentration der verwendeten NPs und Zelllinien variieren. Für RAW264.7-Makrophagen beobachteten wir, dass eine 30-minütige Inkubation mit NPs bei einer Konzentration von OD₅₂₀ = 0,05 eine ausreichende Internalisierung ermöglichte.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schema zur Vorbereitung von HeLa-Zellen für die Bildgebung lebender Zellen. HeLa-Zellen wurden 30 Minuten lang in Kammerobjektträger ausgesät, scheininfiziert oder mit verschiedenen Salmonellenstämmen infiziert, 3 Mal mit ...

Materialien